【摘要】：研究背景： 腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)激活參與慢性腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展,若及時將其阻滯,可以減輕蛋白尿,減緩終末期腎臟疾病的進(jìn)展。血管緊張素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)作為RAAS主要效應(yīng)分子,其作用除直接改變腎小球血流動力學(xué)外,還通過多種非血流動力學(xué)機(jī)制發(fā)揮其腎臟損傷作用,如氧化應(yīng)激、細(xì)胞外基質(zhì)聚集、炎癥因子的產(chǎn)生、細(xì)胞骨架的紊亂、細(xì)胞周期失常以及凋亡等。足細(xì)胞作為一種終末分化的上皮細(xì)胞,是腎小球濾過屏障的重要組成部分,其損傷或丟失在蛋白尿的發(fā)生以及腎小球疾病的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。本實驗組前期研究已經(jīng)證實,Ang Ⅱ可誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。但其具體分子機(jī)制仍未完全清楚。近期研究發(fā)現(xiàn)支架蛋白IQ domain GTPase-activating protein1(IQGAP1)在人體內(nèi)廣泛表達(dá),且在多種細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮重要作用。但I(xiàn)QGAP1是否參與Ang Ⅱ誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡尚未見報道,本研究旨在探討IQGAP1在Ang Ⅱ誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡中的作用以及可能的分子機(jī)制。為足細(xì)胞病理生理研究及IQGAP1分子生物學(xué)功能的深入發(fā)掘提供新的理論依據(jù)。 方法： 第一部分：36只SPF級雄性Wistar大鼠隨機(jī)數(shù)字法分為正常對照2周組、生理鹽水輸注2周組、Ang Ⅱ輸注2周組、正常對照4周組、生理鹽水輸注4周組和Ang Ⅱ輸注4周組,每組大鼠6只。每周末測量大鼠血壓及24h尿蛋白量。分別于14天、28天處死動物取腎,PAS染色觀察腎組織病理學(xué)改變,電鏡觀察足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變,TUNEL檢測足細(xì)胞凋亡。免疫組化、免疫熒光、real-time PCR、Western blotting檢測IQGAP1在腎小球的表達(dá)及分布。Western blotting檢測腎小球半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白表達(dá)。采用偏相關(guān)分析探討IQGAP1蛋白表達(dá)量和caspase-3活化量之間的相關(guān)性。 第二部分：體外培養(yǎng)條件永生性小鼠足細(xì)胞,未分化足細(xì)胞用含10U/ml IFN-γ的培養(yǎng)基在33℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng),然后用不含IFN-y的培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)分化10-14d用于后續(xù)實驗。藥物干預(yù)前無血清培養(yǎng)基同步化12h。(1)隨機(jī)分組：正常對照組、10-8M AngⅡ刺激細(xì)胞不同時間(1h、3h、6h、12h、24h)以及不同濃度(10-12M,10-10M,10-8M,10-6M) AngⅡ刺激細(xì)胞6h組。(2)采用流式細(xì)胞術(shù)以及Hoechst-33258染色檢測足細(xì)胞凋亡率。(3)免疫熒光、real-time PCR及Western blotting檢測足細(xì)胞IQGAP1的表達(dá)及分布。(4)轉(zhuǎn)染IQGAP1siRNA,觀察其對AngⅡ誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的影響。 第三部分：體外培養(yǎng)條件永生性小鼠足細(xì)胞,未分化足細(xì)胞用含lOU/ml IFN-γ的培養(yǎng)基在33℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng),然后用不含IFN-y的培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)分化10-14d用于后續(xù)實驗。藥物干預(yù)前無血清培養(yǎng)基同步化12h。(1)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)通路(包含P38、JNK和ERK1/2三條主要通路)抑制劑SB202190, SP600125或U0126預(yù)處理足細(xì)胞,觀察其對IQGAP1蛋白表達(dá)及AngⅡ誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的影響。(2)轉(zhuǎn)染IQGAP1siRNA,觀察其對MAPK信號蛋白磷酸化水平的影響。(3)采用免疫共沉淀法研究IQGAP1與ERKl/2結(jié)合水平的變化。 結(jié)果： 第一部分：(1)AngⅡ輸注組大鼠血壓升高,實驗第14天達(dá)峰值并維持在較高水平；第7天時便出現(xiàn)顯著蛋白尿,且隨時間的延長尿蛋白量持續(xù)增加,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)AngⅡ輸注組出現(xiàn)輕度系膜細(xì)胞增殖和系膜基質(zhì)增加,生理鹽水輸注組和正常對照組均未見明顯病理改變。(3)透射電鏡觀察足細(xì)胞顯示,AngⅡ輸注2周組及4周組均可見明顯的足突融合、消失,并伴有染色質(zhì)凝集以及核固縮、核碎裂等足細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)。生理鹽水輸注組和正常對照組均未見明顯改變。(4)TUNEL顯示,AngⅡ輸注后足細(xì)胞凋亡顯著增加；免疫印跡發(fā)現(xiàn),AngⅡ輸注后大鼠腎小球caspase-3活化明顯增加(P0.05)。(4)正常對照組IQGAP1沿毛細(xì)血管袢線性分布,與nephrin共定位表達(dá),AngII輸注后IQGAP1表達(dá)量顯著增加(P0.05),且其蛋白表達(dá)與caspase-3活化量呈顯著正相關(guān)(r=0.689,P0.05)。 第二部分：(1)AngⅡ以劑量和時間依賴方式誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。(2)正常足細(xì)胞IQGAP1主要分布于胞膜和胞漿,AngⅡ誘導(dǎo)足細(xì)胞IQGAP1mRNA及蛋白表達(dá)增加,呈劑量和時間依賴性。(3)IQGAP1siRNA轉(zhuǎn)染足細(xì)胞顯著減輕AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P0.05)。 第三部分：(1)SB202190, SP600125或U0126預(yù)處理足細(xì)胞,可分別顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P0.05)。但不影響IQGAP1蛋白表達(dá)。(2)IQGAP1siRNA轉(zhuǎn)染足細(xì)胞顯著下調(diào)ERK1/2磷酸化水平(P0.05),降低IQGAP1與ERK1/2結(jié)合量(P0.05),但對于P38以及JNK通路無顯著影響。 結(jié)論： (1) AngⅡ在體內(nèi)、外均能誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。(2)足細(xì)胞表達(dá)IQGAP1,且主要分布于胞膜及胞漿。(3) AngⅡ刺激足細(xì)胞IQGAP1表達(dá)上調(diào),IQGAP1通過ERK1/2MAPK信號通路介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

注：Control:正常對照組；NS:生理鹽水輸注組；Angll: Angll輸注組標(biāo)尺=20|xm圖1.3各組大鼠腎組織病理學(xué)改變（PASX400)Control NS Ang II

Q\0_W注：Control:正常對照組；NS:生理鹽水輸注組；Angll: Angll輸注組標(biāo)尺=20|xm圖1.3各組大鼠腎組織病理學(xué)改變（PASX400)
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R692

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本文編號：2553809