【摘要】：目的：探討前體蛋白加工酶PACE4在前列腺增生(Benign prostatic hyperplasia,BPH).前列腺上皮內(nèi)瘤變(Prostate intraepithelial neoplasia,PIN)及前列腺癌(Prostate cancer,PCa)組織中的表達及其與前列腺癌臨床分期、血清PSA水平、Gleason評分之間的關(guān)系；在細胞水平驗證PACE4的表達與細胞增殖能力和侵襲能力的關(guān)系,預測分析PACE4的干擾niRNA,驗證miR-124對前列腺癌細胞系DU145中PACE4表達調(diào)節(jié)以及細胞增值、遷徙和侵襲特性的影響,為前列腺癌的診斷、監(jiān)測以及隨診提供新的可供參考的標志物,為前列腺癌的治療提供新的靶點。 方法：應用免疫組化SP法檢測PACE4在72例前列腺癌、10例前列腺上皮內(nèi)瘤變和40例良性前列腺增生癥組織中的表達,并與前列腺癌臨床分期、血清PSA水平及Gleason評分之間的關(guān)系進行統(tǒng)計學分析；培養(yǎng)前列腺癌細胞系DU-145、PC.3.LNCaP.C42和前列腺增生細胞株BPH-1,細胞計數(shù)、軟瓊脂克隆實驗和侵襲實驗驗證細胞株的增殖能力和侵襲能力,應用Realtime PCR.Westernblot檢測各細胞株中PACE4及相關(guān)信號分子的表達狀況,應用免疫熒光染色顯示各細胞中PACE4的表達。預測分析PACE4的干擾miRNA,檢測PACE4高表達、低表達和不表達的DU-145.C42和BPH-1中所預測niRNA的表達,根據(jù)上述實驗結(jié)果,通過與信息庫比對預測miR-124直接靶向PACE4-3'UTR,利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗確定目標miRNAs,構(gòu)建pMIR-Report-PACE43'UTR報告質(zhì)粒和pMIR-Report-mut-PACE43'UTR報告質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293T細胞和熒光素酶報告分析系統(tǒng)分析結(jié)果。設計、合成miR-124的oligo片段和inhibitor片段,脂質(zhì)體LipofectamineTM RNAiMAX將其轉(zhuǎn)染進入DU-145、C42和BPH-1細胞內(nèi),Realtime PCR和Westernbloting檢測細胞內(nèi)PACE4mRNA和蛋白水平的表達。利用流式細胞儀檢測DU145細胞轉(zhuǎn)染miR-124以后的細胞周期變化,分析細胞增殖能力；利用Martrix膠侵襲實驗檢測細胞侵襲能力變化。采用免疫細胞染色檢測轉(zhuǎn)染miR-124后,DU-145細胞表達MUC1的變化,并將實驗結(jié)果進行分析。 結(jié)果：(1)PACE4在PCa.PIN及BPH中的陽性率分別為92%、80%及20%,PCa和BPH兩組中的陽性表達差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而在PCa和PIN中的陽性表達無明顯差異(P0.05).PACE4在前列腺癌中的表達與患者臨床分期.血清PSA水平、腫瘤分級(Gleason評分)密切相關(guān)(P0.05).PACE4陽性率與腫瘤臨床分期呈正相關(guān)(P0.01),Ⅰ期和Ⅲ期、Ⅳ期之間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與Gleason評分呈正相關(guān)(P0.01),隨腫瘤Gleason評分的增高PACE4陽性率呈上升趨勢。術(shù)前PSA水平10ng/ml和20ng/ml兩組組間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。PACE4在有無骨轉(zhuǎn)移兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 (2)培養(yǎng)前列腺癌細胞株DU-145、PC3、LNCaP、C42及前列腺增生細胞株BPH-1,其中DU-145細胞的增殖能力和侵襲能力最強,C42在PCa細胞株中增殖能力和侵襲能力最弱。利用Realtime PCR和Western blot檢測細胞中PACE4及相關(guān)信號分子的表達,發(fā)現(xiàn)PACE4在DU-145中表達最高,前列腺癌細胞株中C42較少,所有細胞株中BPH-1最少,同時其關(guān)信號分子基因水平IGFBP3和THBS1表達及Furin、Seprine2、MUC、CDK6高表達,蛋白水平P53、MUC1及PTEN高表達,細胞免疫熒光顯示DU145細胞中PACE4的表達也最高,以上結(jié)果提示PACE4表達水平與前列腺癌惡性程度及侵犯轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 (3)利用生物學軟件預測分析PACE4的干擾miRNAs,根據(jù)預測結(jié)果選取mir-9-5p、mir-506-3p、hsa-mir-124-3p、mir-590-5p和mir-21-5p,選用明確的PACE4高表達、低表達和不表達的DU-145、C42和BPH-1通過Realtime PCR檢測以上miRNAs的表達,發(fā)現(xiàn)miR-124、miR-21在DU-145中的表達明顯低于在BPH-1中的表達,miR-124、miR-21在DU-145和BPH-1中表達存在明顯差異(P0.05)；雙熒光素酶檢測niRNA與PACE43'UTR的關(guān)系,并轉(zhuǎn)染293T細胞,熒光素酶報告分析系統(tǒng)分析結(jié)果,過表達miR-124和miR-21后,報告系統(tǒng)的熒光值顯著減少(P0.05),提示miR-124、miR-21與PACE43'UTR存在靶向關(guān)系；將miR-124轉(zhuǎn)染進入DU-145、C42和BPH-1細胞內(nèi),Realtime PCR和、Vestern blot檢測細胞內(nèi)PACE4mRNA和蛋白水平的表達,并檢測細胞轉(zhuǎn)染miR-124以后的細胞周期變化,分析細胞增殖能力及侵襲能力的變化。發(fā)現(xiàn)將miR-124轉(zhuǎn)染DU-145細胞后,轉(zhuǎn)染組細胞增殖、遷移和侵襲能力減低,細胞周期阻滯,而轉(zhuǎn)染了miR-124inhibitor片段C42細胞和BPH-1細胞的細胞增殖、遷移和侵襲能力升高,細胞表達MUC1水平也同時升高,而轉(zhuǎn)染miR-124后DU145細胞表達MUC-1顯著減少。提示miRNA可通過抑制PACE的表達使細胞的增殖和遷移能力下降,細胞的惡性都減少。 結(jié)論：前列腺癌組織中PACE4高表達,并與前列腺癌的臨床分期、血清PSA水平及Gleason評分有密切相關(guān),提示PACE4可作為前列腺癌的一個有價值的診斷指標。預測分析PACE4的干擾miRNA, miR-124可直接靶向PACE4-3'UTR,將miR-124轉(zhuǎn)染DU-145后細胞增殖、遷移和侵襲能力減低,細胞周期阻滯,提示miR-124可通過抑制PACE4的轉(zhuǎn)錄來抑制前列腺癌的增值和轉(zhuǎn)移。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.25

【參考文獻】

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1 周智;張保華;祝誠;薛立群;王紅梅;;前蛋白轉(zhuǎn)換酶Furin和PC7在小鼠母胎界面的動態(tài)表達及其在胚胎粘附和擴展中的作用[J];動物學報;2008年05期

2 岑暢飛;付淑芳;陳鳳儀;劉先哲;;血管緊張素Ⅱ?qū)Υ笫笱芷交〖毎チ值鞍酌副磉_的影響[J];中華老年心腦血管病雜志;2011年10期

3 吳琪俊;徐劍鋒;施榕;;前列腺癌易感基因及遺傳流行病學研究進展[J];上海交通大學學報(醫(yī)學版);2011年05期

4 員月明;李弘劍;;人β-酪蛋白GAS基序熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建與鑒定[J];生物技術(shù)通報;2011年10期

5 酈俊生;楊銀才;李立;潘良;沙鍵;程捷;江魚;;PSA、ECT骨顯像診斷前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的臨床意義[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學;2007年09期

6 劉大全;劉濤;湯華;;雙熒光蛋白報告基因分析系統(tǒng)在微小RNA研究中的應用[J];天津醫(yī)科大學學報;2009年01期

7 李恒;胡志全;;前列腺癌冷凍消融治療新進展[J];現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志;2011年06期

8 高興;蔡云;辛海明;張曉兵;揚新;劉澤軍;;人Bax啟動子熒光素酶報告基因的構(gòu)建和鑒定[J];腫瘤學雜志;2009年01期

9 朱雄增;;學習和掌握腫瘤的WHO分類,提高病理診斷和研究的水平[J];中華病理學雜志;2006年11期

10 蔣學祥,王霄英,肖江喜,王紀琛,高玉潔;前列腺癌的MRI診斷[J];中國醫(yī)學影像技術(shù);2001年09期

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