【摘要】：研究背景 慢性腎臟病是一種以進行性腎功能惡化為特征的腎臟疾病。其中相當(dāng)比例的患者最終進展為終末期腎功能衰竭而需要終生透析或腎移植來治療。 腎間質(zhì)纖維化是腎臟疾病進展到終末期腎功能衰竭的共同途徑。在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中,細(xì)胞遷移發(fā)揮著重要的作用。最常見的是炎癥細(xì)胞遷移浸潤。目前又有研究表明,在細(xì)胞因子、氧自由基等損傷因子刺激下,腎臟固有細(xì)胞(腎小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞等)活化為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)生成細(xì)胞,細(xì)胞粘附力降低及向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變(α-SMA表達增加),從而使細(xì)胞的遷移能力增強,細(xì)胞發(fā)生病理性移位,脫離正常生理位置向間質(zhì)遷移,促進腎間質(zhì)纖維化。另外,在腎纖維化進展過程中,成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維母細(xì)胞后,其遷移能力明顯增強,在腎間質(zhì)廣泛浸潤,進一步加重腎臟損傷。TGF-β1是一個促纖維化的因子。體外實驗發(fā)現(xiàn),TGF-β1刺激可引起腎小管上皮、系膜細(xì)胞及腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮等腎臟固有細(xì)胞遷移能力增強。然而細(xì)胞遷移的具體機制尚不清楚。 ELMO1是一個吞噬和細(xì)胞運動性蛋白。ELMO1與Dock180形成復(fù)合物,作為Racl的GEF,特異性激活Rac1,促進細(xì)胞遷移。研究發(fā)現(xiàn),ELMO1與慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腎間質(zhì)纖維化模型—UUO大鼠中發(fā)現(xiàn),ELMO1在腎臟組織中表達明顯升高,且主要分布在近端腎小管上皮細(xì)胞中。TGF-β1刺激腎小管上皮細(xì)胞,ELMO1表達明顯上升及細(xì)胞遷移增強。用抗Thy1.1(E30)抗體注射大鼠形成的慢性腎小球腎炎模型中,受損區(qū)的腎小球上皮細(xì)胞及浸潤的間質(zhì)細(xì)胞中ELMO1表達明顯升高。過表達ELMO1的細(xì)胞能促進細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分泌、減少細(xì)胞黏附分子的表達,抑制細(xì)胞之間的黏附及細(xì)胞向ECM粘附,增加細(xì)胞的活動度。這些研究提示：ELMO1通過多條途徑(包括本研究關(guān)注之一：細(xì)胞遷移)共同參與了慢性腎臟病的發(fā)生。然而具體機制尚不清楚。 最近研究發(fā)現(xiàn),ELMO1的酪氨酸磷酸化在參與調(diào)控細(xì)胞遷移中起著重要作用。ELMO1可以被Src激酶家族成員Hck磷酸化,其中Y18、Y216、Y395,Y511F和Y720五個酪酸酸位點能被Hck明顯磷酸化。抑制Src激酶活性及單點或多點突變ELMO1,細(xì)胞遷移減弱,尤其是4YF(Y18、Y216、Y395和Y511F)。但是ELMO1的酪氨酸磷酸化影響細(xì)胞遷移的具體機制尚不清楚。而我們的前期研究發(fā)現(xiàn)了一個與ELMO1相互作用的新分子-Nck-1。 Nck-1由N端三個SH3結(jié)構(gòu)域和一個C末端的SH2結(jié)構(gòu)域組成。Nckl-SH2結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合活化的酪氨酸激酶受體和酪氨酸磷酸化的船屋蛋白(docking proteins),而Nck-1的SH3結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合許多調(diào)控細(xì)胞骨架運動的蛋白。目前大量研究發(fā)現(xiàn),Nck-1通過SH2結(jié)構(gòu)域接受細(xì)胞內(nèi)、外酪氨酸磷酸激酶信號,再經(jīng)SH3結(jié)構(gòu)域?qū)⑿盘杺鬟f至Arp2/3復(fù)合物,調(diào)控細(xì)胞骨架重排,促進細(xì)胞遷移。 PDGF刺激可引起PDGF受體(PDGFR)的第751位點的酪氨酸發(fā)生磷酸化,Nckl-SH2結(jié)構(gòu)域與該位點結(jié)合,再通過其SH3結(jié)構(gòu)域募集下游更多蛋白復(fù)合物,將信號傳遞至Arp2/3復(fù)合物,調(diào)控細(xì)胞骨架重排,促進細(xì)胞遷移。A36R是位于vaccinia病毒細(xì)胞表面的一個跨膜蛋白,與酪氨酸激酶Src相互作用后活化Src,活化的Src進一步磷酸化A36R第112位點的酪氨酸,A36R通過該位點與Nck-1的SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合,從而通過Nck-1-WASP-Arp2/3復(fù)合物引起細(xì)胞骨架的重排,促進vaccinia病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的傳播。 綜上所述,銜接蛋白Nck-1可以通過其SH2結(jié)構(gòu)域接受細(xì)胞內(nèi)、外酪氨酸磷酸激酶信號,再通過其SH3結(jié)構(gòu)域募集更多蛋白復(fù)合物,促進細(xì)胞遷移。我們前期工作發(fā)現(xiàn)了銜接蛋白Nck1-SH2結(jié)構(gòu)域可以與ELMO1結(jié)合,鑒于ELMO1的酪氨酸磷酸化對細(xì)胞遷移起著重要作用以及Nck-1可以介導(dǎo)酪氨酸磷酸化信號促進細(xì)胞遷移,那么我們推測ELMO1可能通過其酪氨酸磷酸化位點與Nck-1相互作用促進細(xì)胞遷移。本研究擬通過如下實驗驗證上述假設(shè)：1、進一步驗證ELMO1與Nck-1的相互作用。2、明確ELMO1與Nck-1的相互作用是否依賴于ELMO1的酪氨酸磷酸化,并確定哪些位點介導(dǎo)兩者之間的相互作用。3、明確ELMO1-Nck-1的相互作用是否能促進細(xì)胞遷移。通過研究ELMO1與Nck-1的相互作用及其功能,為進一步研究ELMO1在慢性腎臟病中的致病機制提供了新的研究思路。 實驗方法 1.細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞來源于中國上海科學(xué)院細(xì)胞庫,細(xì)胞培養(yǎng)在10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為37℃,95%空氣,5%C02。無血清靜置12h后,10μM SU6656刺激HEK293T細(xì)胞2h或者轉(zhuǎn)染Myc-ELMOl質(zhì)粒36小時后用0.1mM Pervanadate(PV)處理HEK293T細(xì)胞20min。 按照Lipofectamine2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)說明書進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或者siRNA干擾細(xì)胞。所有這些實驗中,用空載體或者陰性siRNA來均衡不同樣本間質(zhì)粒溶度和siRNA的量。 2.質(zhì)粒構(gòu)建 人全長的Nck-1cDNA (NCBI收錄號BC006403)擴增及克隆至pRecieverM11表達載體中。為了構(gòu)建Flag-Nckl突變體：Nckl R308K,將Nck-1的SH2結(jié)構(gòu)域中FLVRES序列中保守的精氨酸替換成賴氨酸。通過基于突變AATCC A→GACCCC(756-761)的PCR來構(gòu)建RNAi-resistant Nck-1和R308K。GST-Nck1-SH2質(zhì)粒構(gòu)建：以人的Nck-1為模板,用PCR擴增出SH2結(jié)構(gòu)域序列,連接至pGEX-4T-3表達載體上。根據(jù)文獻構(gòu)建Myc-ELMO1(WT),Myc-ELMO11-625, Myc-ELMO11-495, Myc-ELMO11-315, Myc-ELMO1532-727(△531)及以Myc-ELMO1質(zhì)粒為模板突變Y18F, Y216F,Y395F,Y511F,3YF(18F, Y216F,Y395F),4YF (18F, Y216F, Y395F, Y511F)。人全長的Hck由廣州復(fù)能基因公司構(gòu)建。Flag-Dock180由Dr. Michiyuki Matsuda (Kyoto University, Kyoto, Japan)贈送。 3. siRNA準(zhǔn)備 Nckl siRNA由中國上海吉瑪基因公司設(shè)計合成。Nckl siRNA序列為：GCAGAAUAAUCCAUUAACUTT;陰性對照序：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT。 4. GST pull down實驗 pGEX-4T-3質(zhì)粒(GST), pGEX-Nck1-SH2質(zhì)粒(GST-Nckl-SH2)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL-21,加入IPTG至0.6mM,37℃誘導(dǎo)4小時。按照說明書操作,用谷胱甘肽瓊脂糖珠GSH-Sepharose4B beads (Amersham Biosciences, NJ, USA)純化GST融合蛋白和GST-Nckl-SH2融合蛋白。PBS洗滌3次后,使用前存放于-80℃C。 準(zhǔn)備好細(xì)胞裂解液,15,000g離心15分鐘,取上清與預(yù)清洗的谷胱甘肽瓊脂糖珠(GST-conjugated Sepharose beads)在40C孵育1小時。5000g離心5分鐘,取預(yù)清洗的細(xì)胞裂解液與GST或者GST-Nck-1-SH2共軛的谷胱甘肽瓊脂糖珠在40C孵育3小時,5000g離心5分鐘。與瓊脂糖珠結(jié)合的蛋白用冰的補加有蛋白酶抑制劑Cocktail的PBS清洗3次。最后與瓊脂糖珠結(jié)合的蛋白用SDS上樣緩沖液煮沸5分鐘,洗脫的蛋白經(jīng)SDS-PAGE進行western blot檢測。 5.免疫印跡(Western blot)和免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation) 不同處理的細(xì)胞用IP緩沖液(20mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl,1mM EDTA,2mM Na3VO4,5mM NaF,1%(vol/vol) Triton X-100, and protease inhibitor mixture)在4℃裂解30分鐘,12,000rpm離心20分鐘,去除沉淀。上清用考馬斯亮藍G-250(Amresco, USA)檢測蛋白溶度。等量的細(xì)胞裂解液加入所需抗體和protein A/G agarose beads (Roche)4℃共同孵育24小時。3000g離心5分鐘,免疫沉淀物用IP buffer清洗5次,與2×SDS上樣緩沖液混合,然后進行SDS-PAGE, western blot檢測。 6.細(xì)胞遷移實驗 細(xì)胞遷移實驗根據(jù)操作說明說指導(dǎo),使用8pm孔隙小室(BD Falcon).簡單的步驟如下,細(xì)胞用含EDTA胰酶消化后用無血清DMEM培養(yǎng)基清洗1次。細(xì)胞再重懸于無血清DMEM培養(yǎng)基。在下室中加入0.7m110%胎牛血清高糖DMEM,上室中加入含5×104個細(xì)胞DMEM混懸液。細(xì)胞在37℃C培養(yǎng)箱中遷移12小時。用棉簽擦拭小室上表面未遷移的細(xì)胞,小室底部遷移的細(xì)胞用甲醇固定15分鐘后,用結(jié)晶紫溶液(0.5%in PBS)染色30分鐘。在20倍顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞,顯微鏡下隨機取9個視野,遷移細(xì)胞的平均數(shù)作為每次實驗結(jié)果。 7.統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實驗的結(jié)果,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有統(tǒng)計分析由統(tǒng)計軟件SPSS13.0完成。當(dāng)方差齊時,多個樣本均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA,兩兩比較采用LSD,當(dāng)方差不齊時使用Welch檢驗,兩兩比較采用Dennett's T3。兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗。p0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 實驗結(jié)果 1.明確ELMO1與Nck-1相互作用 我們前期工作通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)了Nck-1的SH2結(jié)構(gòu)域與ELMO1結(jié)合。為了進一步明確ELMO1與Nck-1相互作用,在體外實驗中,首先我們檢測外源性的ELMO1與Nck-1是否相互作用,如所預(yù)測的結(jié)果,在共轉(zhuǎn)染Myc-ELMO1與Flag-Nckl的293T細(xì)胞中,用抗Myc標(biāo)簽抗體免疫共沉淀,Western blot能檢測到外源性Flag-Nckl,而用同型對照IgG抗體免疫共沉淀,Western blot不能檢測到外源性Flag-Nckl;反過來,用抗Flag標(biāo)簽抗體免疫共沉淀,Western blot能檢測到外源性的Myc-ELMO1。接下來我們進一步檢測內(nèi)源性的ELMO1與Nck-1相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),無論用ELMO1抗體或Nck-1抗體免疫共沉淀都能檢測到兩者相互作用。因為之前的研究發(fā)現(xiàn)ELMO1的C端532-727氨基酸能與Dock180結(jié)合,Dock180又能與Nck-2結(jié)合。為了驗證Dock180是否參與了ELMO1與Nck-1的相互作用,我們根據(jù)文獻構(gòu)建Myc-ELMO1突變體：ELMO1532-727(A531)和ELMO11-625(T625)。WT, T625,△531分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。GST pull down實驗顯示T625與Nck1-SH2結(jié)合與WT一樣多,而未能檢測到Nckl-SH2與△531的結(jié)合。這些結(jié)果表明Dock180未介導(dǎo)ELMO1與Nck-1的相互作用。進一步截短ELMO1發(fā)現(xiàn),截短體ELMO11-495仍然能夠與Nckl-SH2結(jié)合,而未能檢測到截短體ELMO11-315與Nckl-SH2結(jié)合,提示ELMO1的N端495個氨基酸介導(dǎo)與Nck1-SH2的相互作用。 2. ELMO1與Nck-1相互作用依賴于ELMO1的酪氨酸磷酸化 SH2結(jié)構(gòu)域可以與酪氨酸磷酸化的蛋白結(jié)合,因此我們研究Nckl-SH2與ELMO1相互作用是否與ELMO1酪氨酸磷酸化有關(guān)。首先,我們用廣譜酪氨酸磷酸酶抑制劑P V (pervanadate)處理過表達Myc-ELMO1的HEK293T細(xì)胞,用4G10抗體檢測到PV處理的ELMO1磷酸化水平明顯增(p0.05),同時GST-Pull down實驗發(fā)現(xiàn)ELMO1與Nckl-SH2結(jié)合明顯增強p0.05)。 接下來,我們檢測正常的HEK293T中內(nèi)源性的ELMO1酪氨酸磷酸化水平,免疫沉淀結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在有ELMO1的酪氨酸磷酸化。新近的研究發(fā)現(xiàn),ELMO1可以被Src激酶家族磷酸化,所以我們用Src激酶家族抑制劑SU6656抑制細(xì)胞內(nèi)源性Src激酶家族,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SU6656處理組中Src的磷酸化明顯下降,與正常組相比下降約92%p0.05),與此同時,ELMO1磷酸化水平明顯下降,與正常組相比下降約45%0.05)。Hck屬于Src激酶家族,過表達Hck激酶,ELMO1酪氨酸磷酸化水平明顯升高p0.05),同時我們發(fā)現(xiàn)ELMO1與Nck1-SH2結(jié)合也增強(p0.05)。 研究已經(jīng)鑒定出ELMO1Y18,Y216,Y395, Y511和Y720五個位點的酪氨酸能被Hck激酶明顯磷酸化。為了確定這些酪氨酸殘基位點是否對ELMO1與Nckl-SH2結(jié)合起著重要作用,首先我們構(gòu)建單個酪氨酸位點突變質(zhì)粒Y18F,Y216F, Y395F, Y511F。GST-pull down實驗中發(fā)現(xiàn)Y18F, Y216F, Y395F, Y511F與Nckl-SH2結(jié)合,與WT相比明顯下降(p0.05)；接著我們進一步突變ELMO1中3個酪氨酸殘基18,216,395(3YF)和4個酪氨酸殘基18,216,395,511(4YF),GST-Pull down實驗發(fā)現(xiàn)4YF能進一步減弱與Nckl-SH2結(jié)合,與WT相比下降約90%p0.05)。為了進一步證實上述結(jié)果,WT ELMO1或4YF與HA-Hck和Flag-Nck-1共轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4YF的磷酸化水平明顯下降,與WT相比下降約68%p0.05),4YF與Nck-1結(jié)合也下降,與WT相比下降約30%(p0.05)。 研究報道,Nckl-R308K突變能破壞SH2結(jié)構(gòu)域與酪氨酸磷酸化殘基結(jié)合。我們的研究發(fā)現(xiàn)在共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T Nck-1或者R308K與ELMO1的293T細(xì)胞中,ELMO1與R308K結(jié)合比WT Nck-1明顯下降p0.05),提示了ELMO1的酪氨酸磷酸化位點主要與Nckl-SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合。 3. ELMO1與Nck-1相互作用促進細(xì)胞遷移 研究發(fā)現(xiàn),ELMO1的酪氨酸磷酸化對ELMOl/Dock180復(fù)合物誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移起著重要作用。我們在293T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),WT ELMO1能明顯促進ELMO1-Dock180誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移(p0.05),突變體Y18F, Y216F, Y395F, Y511F能減少細(xì)胞遷移(P0.05),聯(lián)合突變四個位點(4YF)能進一步減少細(xì)胞遷移p0.05)。 我們接著用WT Nck-1或者R308K Nck-1來分析ELMO1與Nck-1之間的相互作用對細(xì)胞遷移的影響。本研究發(fā)現(xiàn),共轉(zhuǎn)染ELMO1-Dock180能促進細(xì)胞遷移(p0.05),共轉(zhuǎn)染Nck-1-ELMO1-Dock180能進一步促進ELMO1-Dock180介導(dǎo)的細(xì)胞遷移(p0.05),而共轉(zhuǎn)染R308K-ELMO1-Dock180卻不能增強ELMO1-Dock180介導(dǎo)的細(xì)胞遷移(p0.05)。 接下來,我們用Nck-1siRNA敲除內(nèi)源性的Nck-1,減少內(nèi)源性的Nckl-ELMO1結(jié)合,觀察細(xì)胞遷移是否下降。沉默內(nèi)源性的Nck-1細(xì)胞遷移明顯下降,與陰性對照組(正常組)相比下降約50%p0.05),重新表達siRNA抵抗的WT Nck-1能恢復(fù)細(xì)胞的遷移(p0.05),而R308K卻不能恢復(fù)細(xì)胞遷移p0.05)。這些結(jié)果說明了Nck1-SH2結(jié)構(gòu)域的完整性對于傳導(dǎo)ELMO1的酪氨酸磷酸化信號及其促進細(xì)胞遷移起著重要的作用。 結(jié)論 1. ELMO1與Nck-1之間存在相互作用。 2. ELMO1存在酪氨酸磷酸化。 3. ELMO1與Nck-1的相互作用依賴ELMO1的酪氨酸磷酸化。 4.Hck激酶依賴的Y18,Y216,Y395和Y511酪氨酸磷酸化位點對于ELMO1與Nck-1的相互作用起著重要作用。 5. ELMO1與Nck-1的相互作用促進細(xì)胞遷移。
【圖文】：

36h后收集細(xì)胞。應(yīng)用免疫共沉淀（CO-IP)檢測293T細(xì)胞中外源性的Myc-ELMOl與Flag-Nckl是否相互作用。如圖1-1A顯示，用抗Myc標(biāo)簽抗體免疫共沉淀，Western blot能檢測到外源性Flag-Nckl,而用IgG抗體免疫共沉淀，，Western blot不能檢測到外源性Flag-Nckl;反過來，如圖1-1B顯示，用抗Hag標(biāo)簽抗體免疫共沉淀，Western blot能檢測到外源性的Myc-ELMOl,而用IgG抗體免疫共沉淀

應(yīng)用免疫共沉淀（CO-IP)檢測293T細(xì)胞中內(nèi)源性的ELM01與Nck-1是否相互作用。如圖1-2A顯示，用抗ELM01抗體免疫共沉淀，Western blot能檢測到內(nèi)源性Nck-1,而用IgG抗體免疫共沉淀，Western blot不能檢測到內(nèi)源性Nck-1 ；反過來，如圖1-2B，用抗Nck-1抗體免疫共沉淀，Western blot能檢測至Ij內(nèi)源性的ELMOl，而用IgG抗體免疫共沉淀,Western blot不能檢測到內(nèi)源性ELM01。A BIF： EUtm IFz IgO ?cfc-1iwi He.-, r^i集 p ? ??- ■f" . 技* . 、>擎‘ EUI01 酵貧令
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R692

【共引文獻】

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1 陳歡;JAK/STAT和PI3K/AKT信號通路在TGF-β1介導(dǎo)的大鼠腎臟小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

2 李山林;P-FAK、Paxillin在胃腺癌組織中的表達及其臨床意義[D];鄭州大學(xué);2011年

3 鄭美潔;巖藻糖基化修飾對TGF-β誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞ECM積聚的影響[D];大連醫(yī)科大學(xué);2011年

4 楊磊;ELMO2在肝癌細(xì)胞遷移運動和侵襲中的功能[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

5 陳舟;FAM40A的足細(xì)胞定位及其對細(xì)胞骨架的影響[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2013年

6 張鑫;軟脂酸對腎小管上皮細(xì)胞TLR4表達的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2014年

7 鄧玲玲;日本血吸蟲Wnt信號通路受配體相互作用[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

8 張果;ELMO1與Nck-1 SH2結(jié)構(gòu)域的相互作用促進Rac1的活化[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

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