【摘要】：研究背景和目的糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病患者常見的慢性微血管并發(fā)癥,其發(fā)病率隨著糖尿病的快速增長而逐年上升,已成為終末期腎病的主要原因,DKD的防治也成為內(nèi)分泌科和腎臟科醫(yī)師面臨的難題之一。然而該病的發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明,既往認(rèn)為DKD的早期病變部位主要在腎小球,近年來的研究發(fā)現(xiàn)腎小管病變無論從發(fā)病時間或發(fā)病機(jī)制看均有其獨(dú)立性,并且腎小管病變及腎間質(zhì)纖維化的程度與腎功能的相關(guān)性比腎小球硬化與腎功能的相關(guān)性更為密切,故腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制越來越受到人們重視。腎間質(zhì)纖維化是DKD的重要的病理特征,表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的沉積,主要包括膠原和纖連蛋白沉積。肌成纖維細(xì)胞是產(chǎn)生ECM的重要來源。腎小管上皮細(xì)胞在病理?xiàng)l件下失去上皮細(xì)胞的特性而獲得肌成纖維細(xì)胞的特性,轉(zhuǎn)化為間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞的過程稱為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。研究表明腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是肌成纖維細(xì)胞的重要來源,且在糖尿病腎臟病的發(fā)生和發(fā)展中起重要的作用。阻止EMT可能是延緩小管間質(zhì)損傷進(jìn)展的主要措施。因此進(jìn)一步尋求阻斷腎小管上皮細(xì)胞損傷及腎間質(zhì)纖維化作用的手段,將是今后研究防止DKD持續(xù)進(jìn)展和保護(hù)腎功能的重要目標(biāo)。微小RNA(miRNA)是長約22個堿基的短鏈非編碼RNA,它通過與靶基因的3’非翻譯區(qū)(3'UTR)結(jié)合,使靶基因沉默或者降解,起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)的作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過2000種人類的miRNA,以及超過60%的人類蛋白編碼基因接受miRNA的調(diào)控。因此miRNA靶向調(diào)控大量的基因,從而參與了眾多疾病發(fā)生和發(fā)展的過程。近年來的研究表明,miR-26和miR-30家族在多器官組織的纖維化、凋亡等病理生理進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用。在特發(fā)性肺纖維化細(xì)胞模型中,miR-26a通過抑制靶基因Lin28B進(jìn)而調(diào)控let-7d的表達(dá),從而抑制肺纖維化。NF-κB調(diào)控miR-26a的表達(dá),而miR-26a進(jìn)一步靶向調(diào)控Col-Ⅰ和CTGF,從而緩解心肌纖維化。在豬腎血管疾病模型中,通過原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-26a主要表達(dá)在腎小管細(xì)胞中,且在腎血管疾病模型中表達(dá)顯著降低,同時抑制miR-26a則可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)促凋亡蛋白表達(dá)。miR-133和miR-30c均通過抑制靶基因CTGF從而緩解了心肌纖維化。miR-30通過靶作用于Notch1和p53從而抑制足細(xì)胞損傷。但是在糖尿病腎臟病腎纖維化,尤其是在腎小管上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程中,miR-26a和miR-30c的研究較少,因此本研究旨在探索miR-26a和miR-30c在糖尿病腎臟病腎小管上皮細(xì)胞EMT中的作用以及具體機(jī)制。最近研究表明miRNA不但可以調(diào)控多個基因,多個miRNA也可以同時調(diào)控一個基因的表達(dá),形成一張復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從而更加精確地對機(jī)體進(jìn)行調(diào)控。然而,目前在miRNA領(lǐng)域,大多數(shù)研究探索單一miRNA對單一靶點(diǎn)的影響,近年來,多個miRNA協(xié)同靶作用于一個基因和單一niRNA同時調(diào)控多個靶點(diǎn)正在成為熱點(diǎn),比如在乳腺癌中,miR-143和miR-145協(xié)同調(diào)控靶基因ERBB3從而抑制細(xì)胞增殖和侵襲。此外,miR-455同時靶作用于Necdin、 Runxltl和HIF1an三個轉(zhuǎn)錄因子,從而調(diào)控棕色脂肪細(xì)胞的分化。目前在DKD領(lǐng)域,探索多個miRNA協(xié)同參與糖尿病腎臟病的研究較少。本研究致力于探索miR-26a和miR-30c是否能分別調(diào)控糖尿病腎臟病的進(jìn)展,同時探索miR-26a和miR-30c是否具有協(xié)同作用。首先,我們使用TGFβ1 (10ng/ml)刺激腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E),比較miR-26a與miR-30c以及纖維化相關(guān)基因的表達(dá),同時我們檢測了40周齡OLETF大鼠皮質(zhì)中niR-26a與miR-30c的表達(dá),進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證miR-26a、miR-30c與DKD的關(guān)系；通過生物信息學(xué)方法,我們預(yù)測miR-26a和miR-30c均靶作用于CTGF,同時預(yù)測Snail1為miR-30c的靶基因,并且進(jìn)行熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證明假設(shè)；接下來我們在NRK-52E細(xì)胞中分別和同時過表達(dá)或敲除miR-26a與miR-30c,探索miR-26a與miR-3Oc是否協(xié)同作用于腎小管上皮細(xì)胞EMT。機(jī)制部分,我們進(jìn)一步探索miR-26a與miR-30c是否同時調(diào)控ERK1/2和p38 MAPK信號通路,并同時敲除miR-26a與niR-30c的靶基因CTGF和Snail1,觀察是否這兩個轉(zhuǎn)錄因子存在協(xié)同調(diào)控EMT的作用。方法1.細(xì)胞培養(yǎng)將凍存的大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK-52E)置于37℃中水浴鍋中復(fù)蘇,培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基中(含10% FBS),并在37℃、5%C02培養(yǎng)箱中孵育。每2-3天更換新的培養(yǎng)基。2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染(1)miRNA的mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天,細(xì)胞接種于12孔板中,每孔鋪約3*104個細(xì)胞。第二天采用lipo3000進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染(操作按lipo3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行)。miRNA的mimic轉(zhuǎn)染濃度為50nM, miRNA的inhibitor轉(zhuǎn)染濃度為150nM,共轉(zhuǎn)染2種miRNA的]mimic/inhibitor時,則每種mimic/inhibitor用量減半,保證每組miRNA的mimic/inhibitor用量相等。(2) siRNA瞬時轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天,細(xì)胞接種于12孔板中,轉(zhuǎn)染時每孔鋪約3*104個細(xì)胞。第二天采用lipo3000進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染(操作按lipo3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行)。siRNA轉(zhuǎn)染濃度為50nM。共轉(zhuǎn)染2種siRNA時,則每種siRNA用量減半,保證每組siRNA用量相等。(3)質(zhì)粒和mimic共轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染前一天,細(xì)胞接種于24孔板中,轉(zhuǎn)染時每孔鋪約1.5*104。第二天采用lipo3000進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染(操作按lipo3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行)。24孔板中mimic的轉(zhuǎn)染量為50nM,熒光素酶報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為1μg,內(nèi)參β-gal質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量均為0.2μg。共轉(zhuǎn)染2種miRNA的mimic時,則每種mimic用量減半,保證每組niRNA的mimic用量相等。3.RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時熒光定量PCR (qRT-PCR)Trizol法提取細(xì)胞組織總RNA,使用分光光度計定量核酸。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR法進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)�；虮磉_(dá)量按2-△△Ct方法計算得出。β-actin作為內(nèi)參基因。4. Western blot使用RIPA法提取組織或細(xì)胞總蛋白,BCA法測定樣品蛋白濃度,100-C水變性蛋白。配制8%-15%的SDS-PAGE膠,電泳分離樣品蛋白,濕轉(zhuǎn)目的蛋白到PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉或者5%BSA的TBST封閉PVDF膜,將目的蛋白的一抗稀釋后與PVDF膜在4-C搖床上孵育過夜。第二天,PVDF膜置于TBST洗滌,再與熒光二抗(1：15000)避光孵育1h,再次置于TBST洗滌后,在Odyssey近紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)光顯影,并用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Quantity One)分析結(jié)果。5.動物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)使用40周齡自發(fā)性2型糖尿病大鼠(OLETF鼠,n=3)和同系野生型非糖尿病大鼠(LETO鼠,n=3)腎組織。大鼠由日本大冢制藥株式會社德島研究所提供,在無特定病原體(SPF)條件下單籠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。腎臟凍存于液氮中保存。6.腎組織病理學(xué)收集液氮中凍存的腎組織,用4%多聚甲醛固定24h,石蠟包埋、切片。Masson染色法用于觀察腎組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)；免疫組織化學(xué)法用于分析CTGF和Snail 1的表達(dá)情況。腎組織切片被兔抗CTGF多克隆抗體以1：100或兔抗Snail 1多克隆抗體以1：100孵育,再用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的二抗孵育,最后蘇木素復(fù)染。正置顯微鏡觀察所有染色切片。7.熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)構(gòu)建野生型CTGF和Snail 1的3'UTR區(qū)載體,使用快速點(diǎn)突變試劑盒突變與3'UTR區(qū)位點(diǎn)結(jié)合的miRNA的種子序列區(qū)。按照碧云天熒光素酶試劑盒說明書在多功能酶標(biāo)儀上測定RLU值以及檢測p-半乳糖苷酶的吸光度。8.統(tǒng)計分析采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理,各指標(biāo)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(X±SEM)表示。多組均數(shù)比較采用單向方差分析(One-way ANOVA),多重比較采用LSD法(Least-significant difference test);方差不齊時,用Welch法校正,多重比較采用Dunnett's T3法。正態(tài)分布兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P0.05時被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1. miR-26a和niR-30c在TGFβ1誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞和OLETF大鼠腎皮質(zhì)中的變化10ng/mLTGFβ1刺激NRK-52E細(xì)胞72h, Western Blot和qRT-PCR檢測均發(fā)現(xiàn)：與Control組相比,TGFβ1組中FN、Col-Ⅰ、α-SMA、CTGF和Snail 1表達(dá)均顯著升高,E-cadherin表達(dá)顯著下降。同時,qRT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)：與Control組相比,TGFβ1組中miR-26a和miR-30c表達(dá)均顯著下降。這表明miR-26a和miR-30c均可能參與到DKD的進(jìn)程。取我們實(shí)驗(yàn)室既往保存于液氮中的40周齡的LETO和OLETF大鼠腎臟皮質(zhì),通過masson染色證實(shí)40周齡的OLETF大鼠腎臟出現(xiàn)明顯的腎間質(zhì)纖維化。免疫組化和western blot結(jié)果均顯示,與LETO非糖尿病大鼠相比,OLETF大鼠腎皮質(zhì)CTGF和Snail 1蛋白表達(dá)明顯升高。通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),與LETO非糖尿病大鼠相比,OLETF大鼠腎皮質(zhì)的miR-26a和miR-30c的表達(dá)均顯著下調(diào)。這進(jìn)一步表明,miR-26a和]miR-30c可能參與DKD的發(fā)病進(jìn)程。2. miR-26a和miR-30c通過靶基因CTGF和Snail 1協(xié)同調(diào)控TGFβ1誘導(dǎo)的EMT1)靶基因鑒定a) Targetscan生物信息學(xué)軟件預(yù)測CTGF基因3'UTR區(qū)中含有miR-26a和miR-30c的結(jié)合位點(diǎn),而Snail 1基因3'UTR區(qū)中也含有miR-30c的結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了miR-26a和miR-30c均靶作用于CTGF且具有協(xié)同作用,而miR-30c靶作用于Snail1。b) Western blot和qRT-PCR檢測均證明轉(zhuǎn)染miR-26a或miR-30c的mimic下調(diào)CTGF的表達(dá),共轉(zhuǎn)染miR-26a和miR-30c的mmic具有協(xié)同下調(diào)CTGF的作用；而轉(zhuǎn)染miR-30c的mimic下調(diào)Snail 1的表達(dá)。2) miR-26a和miR-30c協(xié)同調(diào)控NRK-52E細(xì)胞EMTa) Western Blot和qRT-PCR檢測均證明：在存在TGFβ1的情況下,轉(zhuǎn)染miR-26a或niR-30c的mimic均下調(diào)FN、Col-Ⅰ和α-SMA,上調(diào)E-cadherin;共轉(zhuǎn)染miR-26a和miR-30c的mimic則協(xié)同下調(diào)FN、Col-Ⅰ和α-SMA,并且協(xié)同上調(diào)E-cadherin。b)在存在TGFβ1的情況下,轉(zhuǎn)染miR-26a或miR-30c的inhibitor上調(diào)FN、 Col-Ⅰ、α-SMA,同時下調(diào)E-cadherin。共轉(zhuǎn)染niR-26a和miR-30c的inhibitor協(xié)同上調(diào)FN、Col-Ⅰ、α-SMA,同時協(xié)同下調(diào)E-cadherin。3. miR-26a和miR-30c協(xié)同調(diào)控TGFβ1誘導(dǎo)的EMT的機(jī)制探討1)我們進(jìn)一步探討miR-26a和niR-30c協(xié)同調(diào)控NRK-52E細(xì)胞EMT的具體機(jī)制,既往的研究表明,CTGF調(diào)控下游的ERK1/2和p38 MAPK信號通路,因此我們進(jìn)一步探索miR-26a和miR-30c是否協(xié)同調(diào)控ERK1/2和p38MAPK信號通路。結(jié)果表明：miR-26a和miR-30c協(xié)同抑制ERK1/2和p38 MAPK蛋白的磷酸化。這說明miR-26a和miR-30c可能通過協(xié)同抑制CTGF進(jìn)而調(diào)控ERK1/2和p38 MAPK信號通路。2) miR-26a和miR-30c也可能通過CTGF和Snail1這兩個轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而起到協(xié)同作用。我們進(jìn)一步探索CTGF和Snail 1這兩個轉(zhuǎn)錄因子是否具有相互作用。在TGFβ1存在和不存在的情況,轉(zhuǎn)染siCTGF對Snail1無明顯的影響,轉(zhuǎn)染siSnail1對CTGF也無明顯的影響,這說明CTGF與Snail1為互相獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄因子。同時我們探索CTGF和Snail1轉(zhuǎn)錄因子是否協(xié)同調(diào)控NRK-52E細(xì)胞EMT。與對照組相比,分別轉(zhuǎn)染CTGF或者Snail1的siRNA于NRK-52E細(xì)胞顯著緩解TGFβ1誘導(dǎo)EMT。但是共轉(zhuǎn)染CTGF和Snail1的siRNA于NRK-52E細(xì)胞并沒有觀察到明顯的協(xié)同抑制EMT的效應(yīng)。結(jié)論1、miR-26a和miR-30c在TGFβ1誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞以及在40周齡的OLETF大鼠腎臟皮質(zhì)中表達(dá)明顯下調(diào)；2、熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-26a和miR-30c協(xié)同靶作用于與CTGF, miR-30c靶作用于Snail1;過表達(dá)miR-26a或niR-30c分別下調(diào)CTGF表達(dá),同時過表達(dá)niR-26a和miR-30c則協(xié)同下調(diào)CTGF表達(dá)。過表達(dá)miR-30c下調(diào)Snail1表達(dá)；3、與單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-26a和miR-30c的mimic (inhibitor)相比,共轉(zhuǎn)染miR-26a和miR-30c的nimic (inhibitor)協(xié)同抑制(增強(qiáng))TGFβ1誘導(dǎo)的EMT；4、共轉(zhuǎn)染miR-26a和miR-30c的mimic協(xié)同抑制TGFβ1誘導(dǎo)的ERK1/2和p38 MAPK信號通路的激活；5、CTGF和Snail1為相互獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄因子；分別抑制CTGF或Snail1均可抑制TGFβ1誘導(dǎo)的EMT,但是同時抑制CTGF和Snail 1未觀察到明顯的協(xié)同作用。
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２．４邋Ｍａｓｓｏｎ染色法觀察兩組腎組織腎小管間質(zhì)膠原纖維的變化逡逑從Ｍａｓｓｏｎ染色的結(jié)果看到：與非糖尿病野生型ＬＥＴＯ大鼠比較，自發(fā)性２逡逑型糖尿�。希蹋牛裕拼笫竽I小管間質(zhì)中染成藍(lán)色的膠原纖維明顯增多（

納魴」萇掀は赴鉭停希蹋牛裕拼笫笊銎ぶ手械謀浠嶝]3?２．５．２免疫組織化學(xué)法結(jié)果提示：Ｓｎａｉｌｌ在ＯＬＥＴＦ大鼠腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞核逡逑中的表達(dá)明愚高于對照ＬＥＴＯ大鼠，，細(xì)胞核著色呈現(xiàn)深棟色（圖１－６）。逡逑ＯＬＥＴＦ大鼠腎小球細(xì)胞核無明顯深染Ｓｎａｉｌｌ。逡逑ＬＥＴＯ邐ＯＬＥＴＦ逡逑民冷游抑ｐｖ、占承巧巧．奮逡逑g牐選�，龄教；襾喩｀嵱zВ還荊″義希海鄭鄭簟齠�、？＇？邋：？逦｀嶇婋。－、辶x�；：户—＼１－０欏々孰A鰲⑴義希椋鄭鰣�？邋‘４？‘逦？：邋：逦NBＶ、八逡逑

本文編號：2533402