發(fā)布時間：2019-09-04 10:25

【摘要】：研究目的與意義急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)已成為全球性的公共健康問題,其死亡率居高不下且極易發(fā)展為慢性腎病及終末期腎病。其常見的誘因包括:腎缺血再灌注、腎毒性藥物、膿毒癥等。急性腎損傷的病理生理學(xué)機制十分復(fù)雜,免疫炎癥反應(yīng)在急性腎損傷中發(fā)揮了非常關(guān)鍵的作用。急性腎損傷后腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生變性、壞死,釋放損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns,DMAP),后者被模式識別受體(pattern recognition receptor,PRRs)識別進而激活固有免疫反應(yīng)。同時,腎小管上皮細(xì)胞也表現(xiàn)出免疫細(xì)胞的活性,一方面產(chǎn)生炎性介質(zhì),另一方面表達模式識別受體和主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類分子等。腎小管周圍的微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加,表達粘附分子,促進炎癥細(xì)胞的粘附和遷移。此外,各種免疫炎癥細(xì)胞在損傷區(qū)域浸潤,進一步活化釋放大量炎性介質(zhì),導(dǎo)致炎癥反應(yīng)放大以及腎小管上皮細(xì)胞進一步損傷。腎組織內(nèi)這三大類效應(yīng)細(xì)胞相互影響,共同參與了腎臟局部固有免疫及適應(yīng)性免疫功能紊亂,導(dǎo)致腎臟持續(xù)處于過度炎性狀態(tài),是引起急性腎損傷的主要機制。近年來,連接黏附樣分子蛋白(junctional adhesion molecule-like protein,JAML,amical)在免疫細(xì)胞活化和炎癥反應(yīng)中的作用日益受到重視。JAML作為新型的連接黏附分子,是一種分泌性的Ⅰ型跨膜糖蛋白。其結(jié)構(gòu)特點使它不僅可以介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用,而且可以與細(xì)胞內(nèi)蛋白結(jié)合從而介導(dǎo)下游信號通路。然而,JAML在急性腎損傷中是否扮演著重要角色,迄今仍未見報道。所以,探討JAML在急性腎損傷中的作用有非常重要的意義。本課題將探討JAML如何參與腎臟區(qū)域免疫調(diào)節(jié),為闡明腎臟的免疫學(xué)機制,尋找新的免疫治療靶點提供理論依據(jù)。研究方法1.JAML在腎缺血再灌注小鼠模型中的表達變化1.1體內(nèi)模型的建立及JAML的檢測用雄性野生型(wild type,WT)C57BL/6小鼠構(gòu)建急性腎缺血再灌注模型,用蛋白質(zhì)免疫印跡法(westernblot,WB)、實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(Real-time RT-PCR)以及免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry,IHC)檢測JAML在腎缺血再灌注各組織中的表達變化;另外腹腔注射順鉑構(gòu)建急性腎損傷模型,并用IHC檢測JAML的表達變化。1.2 JAML與腎小管不同部位標(biāo)記物共定位用組織免疫熒光法(immunofluoresce,IF)對JAML與腎小管標(biāo)記物蛋白進行熒光共定位。1.3體外模型的建立及JAML的檢測培養(yǎng)人近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2),體外模擬腎缺血再灌注模型:糖氧剝奪法(oxygen glucose deprivation,OGD);給藥抗霉素A/2-脫氧葡萄糖(AA-2DG);給藥氯化鈷(CoCl2)。WB檢測這幾種條件下HK-2細(xì)胞中JAML蛋白水平變化。另外,通過缺氧處理的HK-2細(xì)胞復(fù)氧后,用其上清處理巨噬細(xì)胞,WB檢測巨噬細(xì)胞中JAML的蛋白水平變化。2.JAML在小鼠腎缺血再灌注損傷中的作用2.1野生型與JAML-/-小鼠腎臟功能學(xué)指標(biāo)的對比高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography,HPLC)檢測野生型與JAML-/-(JAML knockout)小鼠血清中肌酐含量。羅氏Cobas 8000全自動生化分析儀分析野生型與JAML-/-小鼠血清中尿素氮的含量。2.2野生型與JAML-/-鼠腎臟形態(tài)學(xué)損傷的對比蘇木素-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)對野生型與JAML-/-小鼠的腎臟石蠟切片進行染色,并進行形態(tài)學(xué)損傷評分。原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling,TUNEL)檢測野生型和JAML-/-小鼠腎臟細(xì)胞凋亡情況。2.3小鼠腎缺血再灌注模型炎癥指標(biāo)檢測Real-time RT-PCR檢測野生型與JAML-/-小鼠腎臟炎癥因子的含量。IHC檢測野生型和JAML-/-小鼠腎臟切片巨噬細(xì)胞標(biāo)記蛋白CD68、中性粒細(xì)胞標(biāo)記蛋白Ly6B。3.在腎缺血再灌注損傷中JAML對下游分子Clec4e的影響通過基因芯片技術(shù)分析腎缺血再灌注野生型和JAML-/-小鼠間的差異表達基因,并繪制模式識別受體家族分子熱圖。Real-time RT-PCR對篩選出來的基因做進一步驗證。RT-PCR檢測巨噬細(xì)胞與HK-2細(xì)胞中模式識別受體Clec4e的表達變化。進而,用AA/2-DG刺激HK-2細(xì)胞觀察Clec4e的變化。研究結(jié)果1.JAML在腎缺血再灌注模型中的表達變化1.1小鼠腎缺血再灌注模型中JAML的表達水平顯著上升RT-PCR和WB證明JAML在成年小鼠灌流干凈的腎臟、脾臟、心臟、小腸、肺中均有表達;Real-time RT-PCR及WB檢測小鼠腎臟中JAML表達。結(jié)果顯示,JAML的mRNA水平與蛋白水平與假手術(shù)組相比顯著上升,這一結(jié)果在IHC中也得到驗證。1.2 JAML主要表達在腎近曲小管中IF檢測發(fā)現(xiàn),JAML主要表達在近曲小管中,外髓質(zhì)遠曲小管也有表達,髓質(zhì)集合管中的表達較弱。1.3體外模型條件下JAML的蛋白水平顯著升高采用三種方法OGD、AA-2DG、CoCl2處理HK-2細(xì)胞,JAML的蛋白水平均顯著升高。用缺氧處理的HK-2上清液培養(yǎng)巨噬細(xì)胞后,巨噬細(xì)胞中JAML蛋白水平同樣升高。2.JAML在腎缺血再灌注損傷中具有促進損傷的作用缺血再灌注后,JAML-/-小鼠血清中肌酐和尿素氮低于野生型小鼠,腎臟損傷減輕,腎臟中浸潤巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量減少,炎癥因子表達下降,凋亡細(xì)胞減少。說明JAML的缺失減輕了腎缺血再灌注損傷。3.JAML調(diào)控Clec4e參與的體外缺血再灌注腎損傷通過基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)Clec4e和其家族個別成員在缺血再灌注損傷后表達明顯上調(diào),JAML缺失可明顯恢復(fù)損傷所誘導(dǎo)的這些基因的表達。Real-time RT PCR證實了這一結(jié)果。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),與巨噬細(xì)胞相比,Clec4e在HK-2細(xì)胞中基礎(chǔ)表達量低,AA/2-DG刺激后誘導(dǎo)其表達升高,說明Clec4e參與了缺氧缺糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷。結(jié)論與創(chuàng)新性1.首次對JAML在急性腎損傷中的表達變化進行表征:腎缺血再灌注損傷小鼠腎臟中JAML的表達顯著升高,且這一結(jié)果也在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷模型中得到證實。2.首次證明JAML促進了腎缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展。因此,下調(diào)JAML的表達可抑制腎缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展和減輕炎癥反應(yīng)。3.初步探討了 JAML促進腎缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的機制,證明其對下游模式識別受體Clec4e的正調(diào)控作用。綜上所述,本課題有助于進一步闡明JAML誘導(dǎo)急性腎損傷的病理生理學(xué)機制,一方面為防治急性腎損傷提供潛在藥物靶點,另一方面,JAML將有可能作為急性腎損傷發(fā)生和發(fā)展檢測的重要指標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R692

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