【摘要】：研究目的與意義急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)已成為全球性的公共健康問題,其死亡率居高不下且極易發(fā)展為慢性腎病及終末期腎病。其常見的誘因包括:腎缺血再灌注、腎毒性藥物、膿毒癥等。急性腎損傷的病理生理學機制十分復雜,免疫炎癥反應在急性腎損傷中發(fā)揮了非常關鍵的作用。急性腎損傷后腎小管上皮細胞發(fā)生變性、壞死,釋放損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns,DMAP),后者被模式識別受體(pattern recognition receptor,PRRs)識別進而激活固有免疫反應。同時,腎小管上皮細胞也表現(xiàn)出免疫細胞的活性,一方面產生炎性介質,另一方面表達模式識別受體和主要組織相容性復合體(MHC)Ⅱ類分子等。腎小管周圍的微血管內皮細胞通透性增加,表達粘附分子,促進炎癥細胞的粘附和遷移。此外,各種免疫炎癥細胞在損傷區(qū)域浸潤,進一步活化釋放大量炎性介質,導致炎癥反應放大以及腎小管上皮細胞進一步損傷。腎組織內這三大類效應細胞相互影響,共同參與了腎臟局部固有免疫及適應性免疫功能紊亂,導致腎臟持續(xù)處于過度炎性狀態(tài),是引起急性腎損傷的主要機制。近年來,連接黏附樣分子蛋白(junctional adhesion molecule-like protein,JAML,amical)在免疫細胞活化和炎癥反應中的作用日益受到重視。JAML作為新型的連接黏附分子,是一種分泌性的Ⅰ型跨膜糖蛋白。其結構特點使它不僅可以介導細胞間相互作用,而且可以與細胞內蛋白結合從而介導下游信號通路。然而,JAML在急性腎損傷中是否扮演著重要角色,迄今仍未見報道。所以,探討JAML在急性腎損傷中的作用有非常重要的意義。本課題將探討JAML如何參與腎臟區(qū)域免疫調節(jié),為闡明腎臟的免疫學機制,尋找新的免疫治療靶點提供理論依據。研究方法1.JAML在腎缺血再灌注小鼠模型中的表達變化1.1體內模型的建立及JAML的檢測用雄性野生型(wild type,WT)C57BL/6小鼠構建急性腎缺血再灌注模型,用蛋白質免疫印跡法(westernblot,WB)、實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應法(Real-time RT-PCR)以及免疫組織化學法(immunohistochemistry,IHC)檢測JAML在腎缺血再灌注各組織中的表達變化;另外腹腔注射順鉑構建急性腎損傷模型,并用IHC檢測JAML的表達變化。1.2 JAML與腎小管不同部位標記物共定位用組織免疫熒光法(immunofluoresce,IF)對JAML與腎小管標記物蛋白進行熒光共定位。1.3體外模型的建立及JAML的檢測培養(yǎng)人近曲小管上皮細胞(HK-2),體外模擬腎缺血再灌注模型:糖氧剝奪法(oxygen glucose deprivation,OGD);給藥抗霉素A/2-脫氧葡萄糖(AA-2DG);給藥氯化鈷(CoCl2)。WB檢測這幾種條件下HK-2細胞中JAML蛋白水平變化。另外,通過缺氧處理的HK-2細胞復氧后,用其上清處理巨噬細胞,WB檢測巨噬細胞中JAML的蛋白水平變化。2.JAML在小鼠腎缺血再灌注損傷中的作用2.1野生型與JAML-/-小鼠腎臟功能學指標的對比高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography,HPLC)檢測野生型與JAML-/-(JAML knockout)小鼠血清中肌酐含量。羅氏Cobas 8000全自動生化分析儀分析野生型與JAML-/-小鼠血清中尿素氮的含量。2.2野生型與JAML-/-鼠腎臟形態(tài)學損傷的對比蘇木素-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)對野生型與JAML-/-小鼠的腎臟石蠟切片進行染色,并進行形態(tài)學損傷評分。原位末端轉移酶標記技術(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling,TUNEL)檢測野生型和JAML-/-小鼠腎臟細胞凋亡情況。2.3小鼠腎缺血再灌注模型炎癥指標檢測Real-time RT-PCR檢測野生型與JAML-/-小鼠腎臟炎癥因子的含量。IHC檢測野生型和JAML-/-小鼠腎臟切片巨噬細胞標記蛋白CD68、中性粒細胞標記蛋白Ly6B。3.在腎缺血再灌注損傷中JAML對下游分子Clec4e的影響通過基因芯片技術分析腎缺血再灌注野生型和JAML-/-小鼠間的差異表達基因,并繪制模式識別受體家族分子熱圖。Real-time RT-PCR對篩選出來的基因做進一步驗證。RT-PCR檢測巨噬細胞與HK-2細胞中模式識別受體Clec4e的表達變化。進而,用AA/2-DG刺激HK-2細胞觀察Clec4e的變化。研究結果1.JAML在腎缺血再灌注模型中的表達變化1.1小鼠腎缺血再灌注模型中JAML的表達水平顯著上升RT-PCR和WB證明JAML在成年小鼠灌流干凈的腎臟、脾臟、心臟、小腸、肺中均有表達;Real-time RT-PCR及WB檢測小鼠腎臟中JAML表達。結果顯示,JAML的mRNA水平與蛋白水平與假手術組相比顯著上升,這一結果在IHC中也得到驗證。1.2 JAML主要表達在腎近曲小管中IF檢測發(fā)現(xiàn),JAML主要表達在近曲小管中,外髓質遠曲小管也有表達,髓質集合管中的表達較弱。1.3體外模型條件下JAML的蛋白水平顯著升高采用三種方法OGD、AA-2DG、CoCl2處理HK-2細胞,JAML的蛋白水平均顯著升高。用缺氧處理的HK-2上清液培養(yǎng)巨噬細胞后,巨噬細胞中JAML蛋白水平同樣升高。2.JAML在腎缺血再灌注損傷中具有促進損傷的作用缺血再灌注后,JAML-/-小鼠血清中肌酐和尿素氮低于野生型小鼠,腎臟損傷減輕,腎臟中浸潤巨噬細胞和中性粒細胞數量減少,炎癥因子表達下降,凋亡細胞減少。說明JAML的缺失減輕了腎缺血再灌注損傷。3.JAML調控Clec4e參與的體外缺血再灌注腎損傷通過基因芯片技術發(fā)現(xiàn)Clec4e和其家族個別成員在缺血再灌注損傷后表達明顯上調,JAML缺失可明顯恢復損傷所誘導的這些基因的表達。Real-time RT PCR證實了這一結果。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),與巨噬細胞相比,Clec4e在HK-2細胞中基礎表達量低,AA/2-DG刺激后誘導其表達升高,說明Clec4e參與了缺氧缺糖誘導的HK-2細胞損傷。結論與創(chuàng)新性1.首次對JAML在急性腎損傷中的表達變化進行表征:腎缺血再灌注損傷小鼠腎臟中JAML的表達顯著升高,且這一結果也在順鉑誘導的急性腎損傷模型中得到證實。2.首次證明JAML促進了腎缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展。因此,下調JAML的表達可抑制腎缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展和減輕炎癥反應。3.初步探討了 JAML促進腎缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的機制,證明其對下游模式識別受體Clec4e的正調控作用。綜上所述,本課題有助于進一步闡明JAML誘導急性腎損傷的病理生理學機制,一方面為防治急性腎損傷提供潛在藥物靶點,另一方面,JAML將有可能作為急性腎損傷發(fā)生和發(fā)展檢測的重要指標。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R692

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 蔣仕林;急性腎損傷診斷和治療(附48例分析)[J];廣西醫(yī)學;2002年09期

2 廖昌興;盧曉玲;曾憲鳳;;基層醫(yī)院獲得性急性腎損傷的臨床特征[J];內科;2007年04期

3 劉天戟;韓冬梅;;125例急性腎損傷診治體會[J];中國實驗診斷學;2007年09期

4 張琳琳;周樹生;劉寶;;急性腎損傷早期診斷生物標記物的研究進展[J];中國急救復蘇與災害醫(yī)學雜志;2008年12期

5 謝潮鑫;孟猛;朱敏敏;蔣蘭麗;;急性腎損傷50例臨床分析[J];中國中西醫(yī)結合腎病雜志;2008年12期

6 唐舸;;主動脈夾層動脈瘤并急性腎損傷4例[J];中國血液凈化;2009年05期

7 梅長林;;加強急性腎損傷的基礎及臨床研究,不斷提高診治水平[J];上海醫(yī)學;2009年03期

8 張益民;;急性腎損傷的遠期預后[J];中國中西醫(yī)結合腎病雜志;2009年07期

9 張小剛;張小麗;;36例急性腎損傷病因及預后分析[J];中國中西醫(yī)結合腎病雜志;2010年04期

10 戴暉;;47例老年慢性腎臟病合并急性腎損傷相關因素的分析[J];中國中西醫(yī)結合腎病雜志;2010年06期

相關會議論文 前10條

1 王琴;牟姍;嚴玉澄;顧樂怡;朱銘力;周文彥;施蓓莉;倪兆慧;;院內慢性腎臟病基礎上急性腎損傷的調查[A];第十一屆全國中西醫(yī)結合腎臟病學術會議論文匯編[C];2010年

2 李雪梅;;藥物導致的急性腎損傷[A];中華醫(yī)學會腎臟病學分會2010學術年會專題講座匯編[C];2010年

3 周奕菁;徐宏;;慢性腎臟病基礎上的急性腎損傷的相關因素分析[A];2007年浙滬兩地腎臟病學術年會資料匯編[C];2007年

4 劉朋飛;馮業(yè)童;董超;劉迪;吳璇;吳昊昱;石毅;周余來;;骨髓間充質干細胞聯(lián)合維生素E對急性腎損傷的治療研究[A];第三屆泛環(huán)渤海（七省二市）生物化學與分子生物學會——2012年學術交流會論文集[C];2012年

5 何飛;張均;盧中秋;高慶齡;沙杜鵑;范國峰;裴力剛;;冠狀動脈支架植入術后急性腎損傷的危險因素和預后分析[A];中華醫(yī)學會急診醫(yī)學分會第十六次全國急診醫(yī)學學術年會論文集[C];2013年

6 韓國鋒;高晶;顧勇;孫晶;張金元;;203例急性腎損傷流行病學分析[A];《中華急診醫(yī)學雜志》第八屆組稿會暨急診醫(yī)學首屆青年論壇論文匯編[C];2009年

7 王琴;倪兆慧;牟姍;嚴玉澄;顧樂怡;戴慧莉;朱銘力;施蓓莉;車妙琳;吳青偉;;尿白介素-18在慢性腎臟病基礎上急性腎損傷診斷中的意義[A];第10屆全國中西醫(yī)結合腎臟病學術會議論文匯編[C];2009年

8 李家瑞;由希雷;;急性腎損傷的營養(yǎng)治療[A];中華醫(yī)學會第12次全國內科學術會議論文匯編[C];2009年

9 閆素英;;急性腎損傷[A];2010全國中西醫(yī)結合危重病、急救醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2010年

10 陳香美;謝院生;;急性腎損傷的修復再生[A];第十一屆全國中西醫(yī)結合腎臟病學術會議論文匯編[C];2010年

相關重要報紙文章 前8條

1 記者 譚嘉;急性腎損傷防治應城鄉(xiāng)有別[N];健康報;2013年

2 湖南省人民醫(yī)院 主任醫(yī)師 梁玉梅 主治醫(yī)師 陳a音;濫用抗生素引發(fā)急性腎損傷[N];大眾衛(wèi)生報;2013年

3 ;藥物對體外沖擊波碎石術所致老年人急性腎損傷的防護作用[N];中國醫(yī)藥報;2003年

4 記者 唐聞佳;兩成急性腎損傷源自亂吃藥[N];文匯報;2011年

5 本報記者 朱國旺;急性腎衰要早期診治規(guī)范用藥[N];中國醫(yī)藥報;2008年

6 海上飛魚;透析,并非越多越好[N];醫(yī)藥經濟報;2008年

7 本報記者 李穎;警惕慢性腎臟病流行[N];科技日報;2013年

8 本報記者 顧泳;中青年的腎病危機[N];解放日報;2014年

相關博士學位論文 前10條

1 陳純波;急性失代償性心力衰竭引起慢性腎臟病患者的急性腎損傷：尿血管緊張素原的預測作用及預后價值[D];南方醫(yī)科大學;2014年

2 周蒙;PROGRANULIN在急性腎損傷中的作用及機制研究[D];山東大學;2016年

3 杞少華;骨髓間充質干細胞對順鉑所致大鼠急性腎損傷的保護作用和分子機制[D];武漢大學;2013年

4 蔣春明;抑制糖原合成酶激酶3β誘導巨噬細胞表型轉化及其對組織損傷的保護作用[D];南京大學;2016年

5 趙維;鹽酸戊乙奎醚預先給藥對大鼠橫紋肌溶解致急性腎損傷的影響及其相關機制的研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2016年

6 孫凱;肝移植術中靜脈靜脈轉流對術后急性腎損傷的保護作用[D];浙江大學;2016年

7 劉遠輝;miRNA-20a靶向Atg7影響的自噬對造影劑誘導的急性腎損傷的機制研究及新的急性腎損傷危險因素探討[D];南方醫(yī)科大學;2016年

8 李建中;Rictor/mTORC2在急性與慢性腎損傷中作用及機制的研究[D];南京醫(yī)科大學;2016年

9 關雪晶;Klotho對缺血再灌注急性腎損傷中細胞自噬的作用及其機制研究[D];上海交通大學;2015年

10 王璇;不同藥物聯(lián)合預防泛影葡胺誘導急性腎損傷的機制研究[D];天津醫(yī)科大學;2016年

相關碩士學位論文 前10條

1 盧海源;Cs菌絲粉對大鼠膿毒性急性腎損傷中klotho蛋白表達的影響[D];河北聯(lián)合大學;2014年

2 李萌;血清胱抑素C和雙源CT腎灌注成像在評估Debakey Ⅰ型主動脈夾層圍手術期急性腎損傷中的價值[D];河北醫(yī)科大學;2015年

3 潘笑悅;不同劑量順鉑誘導小鼠急性腎損傷模型觀察及生物學指標檢測[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學院;2015年

4 國建;急性腎損傷的病因分析及預后危險因素探討[D];南方醫(yī)科大學;2015年

5 朱建剛;床旁超聲評估嚴重創(chuàng)傷后急性腎損傷的初步研究[D];浙江大學;2015年

6 徐嘉琪;血尿酸升高和RAS抑制劑的使用：兩種非傳統(tǒng)危險因素與心血管住院患者急性腎損傷的關系[D];南方醫(yī)科大學;2015年

7 張仙珍;痛風性關節(jié)炎發(fā)生急性腎損傷危險因素的臨床研究[D];浙江大學;2015年

8 王韋樂;小兒先天性心臟病術后并發(fā)急性腎損傷危險因素及腹膜透析應用的探討[D];南京大學;2014年

9 李U，

本文編號：2531684