【摘要】：背景 腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是發(fā)生于腎實(shí)質(zhì)腎小管上皮(renal tubule epidermis)的惡性腫瘤,約占成人腎臟惡性腫瘤的90-95%。在世界范圍內(nèi),每年由腎細(xì)胞癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)已經(jīng)超過100,000。大約25-30%的腎細(xì)胞癌患者初次就診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移,約1/3的局限性腎癌患者手術(shù)切除腫瘤后會發(fā)生轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移性腎癌患者的5年生存率約為5%-10%。在臨床上手術(shù)切除腫瘤是治療局限性腎細(xì)胞癌的首選方式,但是對于轉(zhuǎn)移性腎癌患者手術(shù)治療效果甚微。而且傳統(tǒng)的化療和免疫治療對于晚期腎癌患者的治療效果不佳。近期興起的腎細(xì)胞癌的靶向藥物治療發(fā)展比較迅速,在所有一線腎細(xì)胞癌靶向治療藥物中最具代表性的就是舒尼替尼和替西羅莫司,它們分別可以阻斷受體酪氨酸激酶(RTKs)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR),但是這些靶向藥物有效率不高,而且價格昂貴。因此我們需要探尋一些價格低廉,而且高效的藥物去抑制晚期腎癌發(fā)展。 他汀類藥物是一類羥甲基戊二酰輔酶A (HMG-CoA)還原酶抑制劑,在臨床廣泛的應(yīng)用于脂代謝異常的病人,可以有效降低膽固醇水平。近期大量研究表明,他汀類藥物具有抑制多種腫瘤進(jìn)展的作用。目前大量臨床試驗(yàn)也對他汀類藥物的抗腫瘤作用進(jìn)行深入研究,而且他汀類藥物的安全性已經(jīng)被大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)�？傮w來說他汀類藥物是一個大家族,包括洛伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀和阿托伐他汀等等。在他汀類藥物家族中,普伐他汀已經(jīng)證實(shí)對于癌細(xì)胞不發(fā)揮任何作用,但是其他他汀類藥物具有廣泛的抗癌作用。不同他汀類藥物抗癌效能不同,或許跟他汀類藥物不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)相關(guān)。尤其跟藥物的親水性或者親脂性相關(guān),親脂性的他汀類藥物易于突破細(xì)胞膜發(fā)揮生物學(xué)作用。所以我們選取親脂性能較好而且臨床廣泛應(yīng)用的他汀類藥物辛伐他汀,研究它在抑制腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用。辛伐他汀是一種羥甲基戊二酰輔酶A (HMG-CoA)還原酶抑制劑,可以競爭性抑制內(nèi)源性膽固醇合成限速酶(HMG-CoA)還原酶,阻斷細(xì)胞內(nèi)羥甲戊酸代謝途徑,使細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成減少。此外辛伐他汀還具有抗炎,調(diào)控免疫,有效的降低老年癡呆的風(fēng)險,減少蛋白尿以減緩腎臟疾病的進(jìn)展的作用。而且更加具有意義的是,越來越多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明辛伐他汀藥物具有廣泛的抗癌作用,包括前列腺癌、乳腺癌、肝癌和結(jié)腸癌等。到目前為止還沒有辛伐他汀對腎癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的研究報道。辛伐他汀對于腎癌細(xì)胞中與腎癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的AKT/mTOR, ERK, JAK2/STAT3和凋亡相關(guān)的信號通路的影響尚未明確。所以本課題第一步分就辛伐他汀對于腎癌細(xì)胞的生物學(xué)作用以及作用相關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)行了深入研究。 兩面針堿是從蕓香科花椒屬植物兩面針的干燥根中提取的一種生物堿。早期的研究表明,兩面針堿具有抗炎,抗真菌,抗氧化,甚至具有抗艾滋病的功能。氯化兩面針堿(Nitidine chloride)是兩面針堿的一種氯化形式,同時實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),氯化兩面針堿能夠抑制體外培養(yǎng)的骨肉瘤細(xì)胞、胃癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖,并且誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。上述研究提示辛伐他汀和氯化兩面針堿對腎癌的防治可能有意義。但目前關(guān)于氯化兩面針堿對腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究尚未有報道。氯化兩面針堿對腎癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為有無影響,以及氯化兩面針堿的抗癌作用所通過的信號通路尚未明確明。所以在本課題第二和第三部分就氯化兩面針堿在腎癌細(xì)胞中抑制轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)凋亡作用以及相關(guān)的信號通路進(jìn)行深入研究。 鑒于目前對于晚期腎癌治療的困境,辛伐他汀和氯化兩面針堿作為一種廉價而且安全的藥物,研究其對腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為可能影響,將是非常有意義的工作。 目的 本研究以腎透明細(xì)胞癌786-0和A498細(xì)胞為模型,探討新型抗腫瘤藥物辛伐他汀和氯化兩面針堿對786-0和A498細(xì)胞活力,凋亡及侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響,并進(jìn)一步研究藥物對細(xì)胞內(nèi)MAPK, AKT/mTOR和JAK2/STAT3通路活性的影響,以尋找治療腎癌的有效藥物。 方法 運(yùn)用細(xì)胞活力檢測試驗(yàn)(MTT assay),克隆形成(Colony formation assay)和流式細(xì)胞凋亡檢測試驗(yàn)(Flow cytometric apoptosis assays)檢測辛伐他汀對于腎癌細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。運(yùn)用劃痕試驗(yàn)(Scratch migration assay)和Transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell invasion and migration assay)檢測了辛伐他汀與腎癌細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)系。通過裸鼠荷瘤試驗(yàn)檢測辛伐他汀對于腎癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的抑制作用。應(yīng)用免疫印跡試驗(yàn)(Weston blot)檢測辛伐他汀對于腎癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白以及AKT/mTOR, ERK和JAK2/STAT3通路的影響。 運(yùn)用細(xì)胞活力檢測試驗(yàn)(MTT assay)和流式細(xì)胞凋亡檢測試驗(yàn)(Flow cytometric apoptosis assays)檢測氯化兩面針堿對于腎癌細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。運(yùn)用劃痕試驗(yàn)(Scratch migration assay)和Transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell invasion and migration assay)檢測了氯化兩面針堿與腎癌細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)系。通過裸鼠荷瘤試驗(yàn)檢測氯化兩面針堿對于腎癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的抑制作用。應(yīng)用免疫印跡試驗(yàn)(Weston blot)檢測氯化兩面針堿對于腎癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白,基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)以及AKT和ERK通路的影響。 結(jié)果 通過MTT檢測細(xì)胞活力試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可以明顯抑制A498和786-0細(xì)胞的增殖,并且具有時間和劑量依賴性�？寺⌒纬稍囼�(yàn)提示辛伐他汀可以明顯抑制A498和786-0細(xì)胞的克隆形態(tài)和克隆數(shù)量。辛伐他汀可以明顯抑制腎癌細(xì)胞在裸鼠皮下的增殖,并且可以誘導(dǎo)體內(nèi)癌細(xì)胞的凋亡。我們進(jìn)一步檢測了辛伐他汀處理的腎癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化,辛伐他汀可以激活腎癌細(xì)胞中的c1eavage-Caspas e-3n cleavage-PARP和Bax,抑制Survivin和Bcl-2的表達(dá)。在我們實(shí)驗(yàn)中,未發(fā)現(xiàn)辛伐他汀對于腎癌細(xì)胞周期有明顯的影響。通過細(xì)胞劃痕試驗(yàn)和Transwell試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可以明顯抑制A498和786-0細(xì)胞的遷移和侵襲。在分子機(jī)制方面,我們應(yīng)用Western blot檢測辛伐他汀在A498和786-0細(xì)胞中對于AKT, mTOR, ERK, JAK2和STAT3的磷酸化的影響。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)中我們應(yīng)用辛伐他汀處理腎癌細(xì)胞可以降低磷酸化ERK。我們進(jìn)一步應(yīng)用siERK1/2敲除ERK1/2,然后應(yīng)用辛伐他汀處理腎癌細(xì)胞可以明顯抑制腎癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,這表明干擾ERK1/2的表達(dá)可以促進(jìn)辛伐他汀的抵抗腎癌的作用。我們進(jìn)一步檢測辛伐他汀對腎癌細(xì)胞中AKT/mTOR通路的影響,我們在A498和786-0細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)AKT/mTOR高表達(dá)。應(yīng)用辛伐他汀處理腎癌細(xì)胞后可以明顯抑制AKT和mTOR的磷酸化。我們進(jìn)一步應(yīng)用siAKT敲除AKT,然后應(yīng)用辛伐他汀處理腎癌細(xì)胞可以明顯抑制腎癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,這表明辛伐他汀可以通過抑AKT抑制腎癌進(jìn)展,干擾AKT的表達(dá)可以促進(jìn)辛伐他汀的抵抗腎癌的作用。我們首次發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可以抑制IL-6介導(dǎo)的腎癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,抑制IL-6激活的JAK2/STAT3通路的磷酸化。我們進(jìn)一步應(yīng)用siSTAT3敲除STAT3,然后應(yīng)用辛伐他汀處理腎癌細(xì)胞可以明顯抑制腎癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,這表明辛伐他汀可以通過抑STAT3抑制腎癌進(jìn)展,干擾STAT3的表達(dá)可以促進(jìn)辛伐他汀的抵抗腎癌的作用。綜合數(shù)據(jù)表明,辛伐他汀可以通過AKT/mTOR, ERK和JAK2/STAT3通路抑制腎癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。 MTT細(xì)胞活力檢測顯示氯化兩面針堿可以明顯抑制786-0和A498細(xì)胞的增殖,并且具有時間和濃度依賴性。通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿可以明顯誘導(dǎo)786-0和A498細(xì)胞的凋亡,并且具有濃度依賴性。氯化兩面針堿可以明顯抑制腎癌細(xì)胞在裸鼠皮下種植的增殖,并且可以明顯誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞在體內(nèi)的增殖。在分子機(jī)制方面,氯化兩面針堿可以激活786-0和A498細(xì)胞中P53, Bax, cleavage-caspase-3和cleavage-PARP的表達(dá),可以抑制Bcl-2, caspase-3和PARP的表達(dá)。我們進(jìn)一步探究氯化兩面針堿對于腎癌細(xì)胞中通路的影響,發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿可以抑制ERK1/2的磷酸化。應(yīng)用ERK1/2抑制劑PD98059發(fā)現(xiàn)抑制ERK1/2可以增強(qiáng)氯化兩面針堿對于腎癌細(xì)胞增殖的抑制作用。綜上所述,氯化兩面針堿可以通過ERK通路發(fā)揮抵抗腎癌的作用。 通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿可以明顯抑制786-0和A498細(xì)胞的遷移。通過Transwell試驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿可以明顯抑制786-0和A498細(xì)胞的侵襲和遷移。在分子機(jī)制方面,氯化兩面針堿可以抑制786-0和A498細(xì)胞中AKT的磷酸化,而且同時可以抑制MMP-2的MMP-9表達(dá)。應(yīng)用AKT特異性抑制劑LY294002抑制AKT的表達(dá)合并應(yīng)用氯化兩面針堿可以增強(qiáng)對腎癌細(xì)胞遷移的抑制作用。綜上,我們發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿可以通過AKT通路抑制腎癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。 結(jié)論 通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可以明顯抑制腎癌細(xì)胞的增殖并且可以誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞的凋亡,通過體外細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可以明顯抑制腎癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。而且辛伐他汀可以而且辛伐他汀可以通過AKT/mTOR, ERK和JAK2/STAT3通路發(fā)揮抑制腎癌的作用。為辛伐他汀的抗腫瘤效應(yīng)提供新的證據(jù),為晚期腎癌的治療提供了新的策略。 氯化兩面針堿可以抑制腎癌細(xì)胞在體內(nèi)和體外的增殖,而且氯化兩面針堿可以通過ERK通路發(fā)揮抑制腎癌增殖的作用。而且氯化兩面針堿可以明顯抑制腎癌細(xì)胞在體外的轉(zhuǎn)移,并且可以通過AKT通路發(fā)揮抑制腎癌轉(zhuǎn)移的作用。為氯化兩面針堿的抗腫瘤作用提供新的依據(jù),而且表明氯化兩面針堿可以作為一種潛在的治療晚期腎癌的策略。 本研究創(chuàng)新點(diǎn) 1.首次發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可以通過抑制IL-6介導(dǎo)JAK2/STAT3通路發(fā)揮抑制腎癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用。 2.首次發(fā)現(xiàn)應(yīng)用氯化兩面針堿可以通過可以通過抑制AKT通路發(fā)揮抑制腎癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。 3.首次發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿可以通過抑制ERK通路發(fā)揮抑制腎癌細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞的凋亡的作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.11
【共引文獻(xiàn)】
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本文編號：
2529448
