【摘要】：第一部分：腎大部切除大鼠殘腎細(xì)胞發(fā)生程序性壞死目的：程序性壞死是一種由細(xì)胞信號(hào)通路精確調(diào)控的細(xì)胞死亡方式,它在許多疾病中發(fā)揮了關(guān)鍵的病理、生理作用。但是,目前它在慢性腎臟病進(jìn)展中的作用卻未見報(bào)道。在本研究中,我們首先測(cè)定了腎大部切除大鼠模型術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn),殘腎固有細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的情況,以證明腎固有細(xì)胞發(fā)生的程序性壞死參與了腎大部切除大鼠的慢性腎損傷。方法：1.將健康雄性的SD大鼠隨機(jī)分為SNX(腎大部切除術(shù),32只)和control (32只)兩組,分別行腎大部切除術(shù)或假手術(shù)造模。并將SNX組和control組實(shí)驗(yàn)大鼠分別按時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為4組：0w、4w、8w、12w組,每組8只。2.測(cè)定腎大部切除大鼠腎功能和腎臟形態(tài)學(xué)改變,并利用電鏡觀察發(fā)生程序性壞死的殘腎細(xì)胞。3.應(yīng)用qPCR、Western Blot及免疫組化法測(cè)定RIP1/3和LC3B的表達(dá)情況。結(jié)果：1.從4w開始,腎大部切除大鼠尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、GSI和TIS明顯增高(P0.05),8w時(shí)這些指標(biāo)進(jìn)一步增高(P0.05),但到12w時(shí)BUN、Scr、GSI和TIS的水平與8w時(shí)比較變化不明顯(P0.05)。2.電鏡結(jié)果顯示：腎大部切除術(shù)后8w,在殘腎組織中可以發(fā)現(xiàn)具有典型壞死形態(tài)特征的程序性壞死細(xì)胞。但在腎大部切除術(shù)后0w,4w,12w均未發(fā)現(xiàn)殘腎細(xì)胞發(fā)生明顯的程序性壞死。3. qPCR和Western Blot結(jié)果顯示：RIP1、RIP3 mRNA、蛋白表達(dá)在腎大部切除術(shù)后4w開始增高；到術(shù)后8w進(jìn)一步增高,較4w組表達(dá)增強(qiáng)(P0.01)；但到術(shù)后12w,增高的RIP1和RIP3 mRNA較8w明顯降低(P0.01),雖然該時(shí)間點(diǎn)RIP1和RIP3蛋白與8w組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但表達(dá)量有所降低。免疫組化結(jié)果顯示：RIP3主要于腎大部切除大鼠殘腎的腎小管上皮細(xì)胞胞漿中表達(dá),而在腎小球中僅見少量RIP3陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)論：1.在腎大部切除大鼠慢性腎損害過(guò)程中,殘腎固有細(xì)胞發(fā)生了程序性壞死。2.殘腎固有細(xì)胞發(fā)生的程序性壞死高峰出現(xiàn)在腎大部切除術(shù)后8w。第二部分：Necrostatin-1對(duì)腎大部切除大鼠慢性腎損傷影響及其機(jī)制目的：應(yīng)用RIP1特異性抑制劑necrostatin-1 (Nec-1)或泛-caspase抑制劑Z-VAD干預(yù)腎大部切除大鼠來(lái)進(jìn)一步探討程序性壞死對(duì)腎大部切除大鼠慢性腎損傷的影響及大鼠殘腎固有細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的可能機(jī)制。方法：1.將SD大鼠隨機(jī)分為SNX(18只)和control(6只)兩組,分別行腎大部切除術(shù)或假手術(shù)。并將SNX組大鼠再分為3組：SNX+vehicle組,SNX+Z-VAD組,SNX+Nec-1組。對(duì)SNX+Z-VAD組和SNX+Nec-1組大鼠,從術(shù)后4w開始分別腹腔注射Z-VAD和Nec-1,共4w。2.評(píng)估Nec-1或Z-VAD對(duì)腎大部切除大鼠腎功能及腎臟病理改變的影響。3.通過(guò)TUNEL染色和電鏡觀察Nec-1或Z-VAD對(duì)腎固有細(xì)胞死亡的影響。4.應(yīng)用qPCR、Western Blot測(cè)定Nec-1或Z-VAD對(duì)RIP1/3、MLKL、PGAM5、Drp1的表達(dá)的影響,并通過(guò)激光共聚焦觀察RIP 1和RIP3在腎組織的表達(dá)位點(diǎn)。5.應(yīng)用DCFH-DA化學(xué)熒光法檢測(cè)腎大部切除大鼠殘腎細(xì)胞內(nèi)ROS含量。結(jié)果：1.電鏡下,在vechile或Z-VAD干預(yù)的腎大部切除大鼠殘腎組織中可以發(fā)現(xiàn)典型的程序性壞死細(xì)胞。但在Nec-1干預(yù)的腎大部切除大鼠及control組大鼠中均未發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞發(fā)生明顯的程序性壞死。2.應(yīng)用Nec-1干預(yù)腎大部切除大鼠后,RIP1和RIP3 mRNA和蛋白水平的增高得以控制(P0.01)。而應(yīng)用Z-VAD干預(yù)后,增高的RIP1和RIP3 mRNA和蛋白水平下降不明顯(P0.05)。激光共聚焦顯微鏡可觀察到：RIP 1和RIP3蛋白主要共表達(dá)于殘腎腎小管上皮細(xì)胞胞漿,在腎小球固有細(xì)胞中僅有少量表達(dá)或不表達(dá)。3.應(yīng)用Nec-1或Z-VAD干預(yù)后,大鼠的腎功能、腎臟病理改變和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較SNX+vehicle組大鼠均有所降低(P0.01)。4.Nec-1干預(yù)的腎大部切除大鼠殘腎PGAM5.Drp1mRNA表達(dá)量較SNX+vehicle組顯著下降(P0.05),但Z-VAD不能抑制增高的PGAM5、Drp1 mRNA表達(dá)(P0.05)。應(yīng)用Nec-1干預(yù)的腎大部切除大鼠殘腎MLKL、Drp1蛋白表達(dá)和ROS含量較SNX+vehicle組顯著下降(P0.05),但PGAM5蛋白表達(dá)下降不明顯(P0.05)。并且發(fā)現(xiàn)Z-VAD對(duì)腎大部切除大鼠MLKL、PGAM5蛋白的高表達(dá)均無(wú)明顯抑制作用(P0.05),但可阻斷Drp1蛋白的高表達(dá)(P0.05)。結(jié)論：1.腎大部切除大鼠殘腎固有細(xì)胞發(fā)生的程序性壞死可能是由RIP1和RIP3共同介導(dǎo)的。2.殘腎固有細(xì)胞發(fā)生的這種RIP 1和RIP3介導(dǎo)的程序性壞死是下游信號(hào)分子MLKL、Drp1和ROS等促發(fā)的。第三部分：Ang 2對(duì)SNX大鼠殘腎細(xì)胞程序性壞死的影響及機(jī)制目的：為了進(jìn)一步探討腎大部切除大鼠殘腎細(xì)胞發(fā)生的這種程序性壞死是由哪些刺激因素誘發(fā)的,我們應(yīng)用Ang 2抑制劑纈沙坦干預(yù)腎大部切除大鼠來(lái)進(jìn)一步探討殘腎固有細(xì)胞發(fā)生的程序性壞死可能是由Ang2誘發(fā)的。方法：1.將SD大鼠隨機(jī)分為SNX組(12只)和control (6只)兩組,分別行腎大部切除術(shù)或假手術(shù)。并將SNX組實(shí)驗(yàn)大鼠再分為2組：SNX組,SNX+valsartan(纈沙坦)組。對(duì)SNX+valsartan組大鼠,從術(shù)后4w開始給予纈沙坦,持續(xù)灌胃4w。2.應(yīng)用qPCR、Western Blot測(cè)定纈沙坦對(duì)Ang2、IP1/3、MLKL、 PGAM5、Drp1的表達(dá)的影響。3.通過(guò)激光共聚焦觀察Ang 2的表達(dá)位點(diǎn)。4.應(yīng)用DCFH-DA化學(xué)熒光法檢測(cè)纈沙坦對(duì)腎大部切除大鼠殘腎細(xì)胞ROS含量的影響。結(jié)果：1.腎大部切除大鼠殘腎Ang 2 mRNA和蛋白水平較對(duì)照組明顯增高(P0.01)。激光共聚焦顯微鏡顯示：Ang 2蛋白主要表達(dá)于殘腎腎小球、腎小管細(xì)胞胞漿。2.應(yīng)用纈沙坦干預(yù)腎大部切除大鼠后,SNX組高水平的RIP1、Drp1mRNA得到控制(P0.05), RIP3 mRNA水平有所降低,但與SNX組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05); RIP1、RIP3、MLKL、Drp1蛋白表達(dá)水平均得以降低(P0.05)；同時(shí),纈沙坦治療后,ROS的水平較SNX組顯著下降(P0.05)。結(jié)論：腎大部切除大鼠殘腎固有細(xì)胞發(fā)生的RIP1和RIP3介導(dǎo)的程序性壞死可能是由Ang 2誘導(dǎo)的。第四部分：程序性壞死、自噬、凋亡在大鼠殘腎細(xì)胞死亡中的相互作用目的：程序性細(xì)胞死亡主要包括凋亡、自噬與程序性壞死三種形式,為了探討CKD進(jìn)展過(guò)程中,腎臟細(xì)胞死亡的方式,我們分別應(yīng)用抑制劑Z-VAD或3-MA或Nec-1干預(yù)腎大部切除大鼠,觀察殘腎程序性細(xì)胞死亡的方式有哪些,以哪種死亡方式為主,它們之間的關(guān)系如何。方法：1.將SD大鼠隨機(jī)分為SNX(24只)和control(6只)兩組,分別行腎大部切除術(shù)或假手術(shù)。并將SNX組實(shí)驗(yàn)大鼠再分為4組：SNX+vehicle組,SNX+Z-VAD組,SNX+Nec-1組和SNX+3-MA組。從術(shù)后4w開始,對(duì)SNX+Z-VAD組、SNX+Nec-1組和SNX+3-MA組大鼠分別腹腔注射Z-VAD、Nec-1和3-MA,連續(xù)4w；對(duì)SNX+vehicle組和control組大鼠僅給予10%DMSO-PBS液。2.應(yīng)用qPCR和Western Blot測(cè)定RIP3、caspase-3、LC3B mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果：1.應(yīng)用Z-VAD干預(yù)后,殘腎caspase-3 mRNA水平明顯下降(P0.01), LC3B、RIP3 mRNA水平變化不明顯(P0.05)。應(yīng)用Nec-1干預(yù)后,殘腎caspase-3 mRNA水平無(wú)明顯下降(P0.05),增高的LC3B、RIP3 mRNA水平明顯降低(P0.01)。應(yīng)用3-MA干預(yù)后,腎大部切除大鼠殘腎增高的LC3B、RIP3 mRNA水平明顯下降(P0.01),增高的caspase-3 mRNA水平變化不明顯(P0.05)。2.應(yīng)用Z-VAD干預(yù)后,殘腎caspase-3蛋白水平明顯下降(P0.05)；RIP3蛋白水平變化不明顯(P0.05)；而LC3B蛋白的表達(dá)反而增高(P0.05)。應(yīng)用Nec-1干預(yù)后,殘腎RIP3和LC3B蛋白水平明顯下降(P0.05)；而caspase-3蛋白水平變化不明顯(P0.05)。應(yīng)用3-MA干預(yù)后,殘腎LC3B、RIP3蛋白水平明顯下降(P0.01)；而caspase-3蛋白水平無(wú)明顯變化(P0.05)。結(jié)論：1.凋亡、白噬和程序性壞死這三種程序性細(xì)胞死亡方式均參與了腎大部切除大鼠的慢性腎臟病理?yè)p害。且這三種程序性細(xì)胞死亡方式是共同存在的,彼此互相聯(lián)系,互相影響。2.自噬可以作為程序性壞死信號(hào)通路的一個(gè)下游分子事件促進(jìn)程序性壞死的發(fā)生。
【圖文】：

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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R692

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本文編號(hào)：2528333