【摘要】：背景：膀胱癌是人類泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率均占泌尿系腫瘤首位,其中約90%為尿路上皮癌。近十幾年來,男性和女性的膀胱癌發(fā)病率均呈上升趨勢。雖經(jīng)多年研究,膀胱癌的發(fā)生發(fā)展的機制目前仍不明確,因此研究膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制對于膀胱癌的預(yù)防及治療具有重要意義。 腫瘤的特征性代謝改變對其生長和增殖具有重要作用。丙酮酸激酶M2亞型(pyruvate kinase M2isoform,PKM2)催化糖酵解最后一步反應(yīng),在多種腫瘤中高表達,且其活性受到多種代謝中間產(chǎn)物和細(xì)胞因子等的調(diào)控,是腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解(Warburg效應(yīng))的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。腫瘤可迅速生成能量并累積糖酵解中間代謝產(chǎn)物用于合成代謝,促進腫瘤的生長和增殖。PKM2在腫瘤代謝和生長中的特殊作用,使其成為腫瘤治療的可能靶點,對PKM2在膀胱癌中的表達和功能進行研究將有助于闡明相關(guān)機制和并具有潛在的應(yīng)用前景。 目的：(1)檢測PKM2在膀胱癌組織及細(xì)胞株中的表達情況,分析PKM2的表達和膀胱癌臨床病理特征之間的關(guān)系。(2)構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾以特異性的敲低PKM2基因,并經(jīng)藥物篩選構(gòu)建穩(wěn)定敲低PKM2的膀胱癌細(xì)胞株。(3)通過體外試驗和體內(nèi)實驗研究PKM2基因敲低對膀胱癌細(xì)胞株糖代謝和生物學(xué)行為的變化。(4)探索PKM2影響人膀胱癌侵襲、轉(zhuǎn)移的可能機制。 方法：(1)收集36例膀胱癌組織及其配對的癌旁組織,采用Western-blot和實時熒光定量-PCR (Quantitative real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)及免疫組織化學(xué)的方法檢測PKM2在膀胱癌組織、配對癌旁組織及膀胱癌細(xì)胞株中的表達水平,并分析其表達水平與膀胱癌臨床病理特征間的關(guān)系。(2)構(gòu)建靶向PKM2基因的pLV-PKM2-shRNA表達載體,包裝病毒后感染膀胱癌細(xì)胞株,采用Western-blot和Real-time PCR檢測shRNA干擾序列對PKM2表達的影響,篩選最優(yōu)的shRNA序列進入后續(xù)試驗。(3)通過藥物篩選構(gòu)建穩(wěn)定敲低PKM2的膀胱癌細(xì)胞株。通過葡糖糖、乳酸測定、CCK8法、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕實驗、Transwell試驗等方法研究PKM2基因敲低對膀胱癌細(xì)胞糖代謝、增殖、凋亡、遷移、侵襲等的影響。通過裸鼠成瘤實驗觀察敲低PKM2對膀胱癌細(xì)胞株活體成瘤能力的影響。通過構(gòu)建膀胱癌原位裸鼠模型和活體小動物發(fā)光實驗觀察PKM2基因敲低對膀胱癌成瘤能力及轉(zhuǎn)移的影響。(4)采用Western-blot和Real-time PCR檢測敲低PKM2后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物的表達變化,探討PKM2影響膀胱癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的可能機制。 結(jié)果：(1)PKM2蛋白和mRNA的表達水平在膀胱癌組織和細(xì)胞株中明顯增高。PKM2的表達水平與組織學(xué)分級和TNM分期正相關(guān)。 (2)成功構(gòu)建了3條pLV-PKM2-shRNA和1條pLV-control-shRNA穩(wěn)定表達的質(zhì)粒。構(gòu)建的3條PKM2-shRNA干擾序列均可顯著敲低T24細(xì)胞PKM2蛋白和mRNA水平的表達,其中PKM2-shRNA-1的干擾效果最顯著。 (3)體外實驗結(jié)果顯示,敲低PKM2使T24細(xì)胞的葡萄糖消耗和乳酸生成降低、增值、凋亡、遷移和轉(zhuǎn)移能力下降,ROS生成增加,對順鉑的敏感性增加。裸鼠成瘤實驗提示敲低PKM2后T24細(xì)胞的成瘤重量和成瘤速度降低。原位膀胱成瘤模型提示敲低PKM2后UMUC-3細(xì)胞成瘤能力降低,轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量減少。(4)敲低PKM2后T24的E-cadherin表達上調(diào),而Vimentin、Fibronectin表達下調(diào)。 結(jié)論：(1)PKM2在膀胱癌組織和細(xì)胞中高表達,其表達與膀胱癌的組織學(xué)分級和TNM分期正相關(guān),PKM2可能在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。(2)體內(nèi)實驗和體外實驗表明,PKM2基因敲低可抑制膀胱癌細(xì)胞的有氧糖酵解、增殖、遷移、侵襲和成瘤能力,并促進ROS生成和凋亡。(3)PKM2可能通過影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進膀胱癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。圖26幅,表27個,參考文獻82篇。
【圖文】：

癌組織圖1-2: PKM2蛋白在膀胱尿路上皮癌組織及其配對癌旁組織中的表達*與配對癌旁組織比較，student's t test , P< 0.00 )1.2.3 Real-time PGR檢測PKM2 mRNA在膀胱尿路上皮癌組織及癌旁組織中的表達提取組織的總RNA的A260/A280的比值均在1.8-2.0之間.，說明含有的小分子雜質(zhì)少，而瓊脂糖凝膠電泳證明實驗中所提取的所有RNA無顯著降解，質(zhì)量良好，可以滿足Real-time PCR實驗的相關(guān)要求。依據(jù)RQ=r‘t的計算方法，15

文 示PKM2mRNA的含量。結(jié)果表明：膀胱尿路上皮癌組織及其中PKM2 mRNA的表達量分別為5.878±1.346和3.683士0.7561，，計學(xué)意義（PCO.OOl)。提示在膀脫尿路上皮癌組織中PKM2的m高于其配對的癌旁正常組織（見表1-6,圖1-3)。表1-6: PKM2 mRNA在膀耽癌尿路上皮癌組織和配對癌旁組織中的表達分組 PKM2 mRNA相對量（RQ值） P值尿路上皮癌組織 5.878±1.346 P<0.001配對癌旁組織 3.683±0.75618-1 *
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.14

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 韓蘇軍;張思維;陳萬青;李長嶺;;中國膀胱癌發(fā)病現(xiàn)狀及流行趨勢分析[J];癌癥進展;2013年01期

2 韓蘇軍;張思維;陳萬青;李長嶺;;中國膀胱癌死亡現(xiàn)狀及流行趨勢分析[J];現(xiàn)代泌尿外科雜志;2013年03期

本文編號：2519610