【摘要】：目的：：腎臟隨年齡的增長出現腎小球硬化及腎小管-間質纖維化，主要原因是胞外基質（ECM）的大量堆積。腎小管上皮細胞間充質改變（EMT）被認為是ECM過度沉積的主要原因之一。既往研究發(fā)現腎臟衰老常伴隨腎間質纖維化，并有部分研究證明，SASP在衰老相關纖維化中扮演重要角色，但具體機制尚不清楚。因此，本研究利用腎臟自然衰老以及長期限食延緩腎臟衰老模型，探索分泌性microRNA對腎小管上皮細胞間充質改變產生影響的可能機制，為臨床預防及延緩腎臟衰老相關纖維化提供重要線索。 方法：1.實驗用F344雄性大鼠，分為3組：YAL：3月齡，自由飲食；OAL：24月齡，自由飲食；OCR：24月齡，限食8個月，飲食熱量為OAL的70%。體內試驗利用SA-β-gal染色，Masson染色、免疫組化、western blot比較三組大鼠腎臟衰老、腎間質纖維化、EMT程度及過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)、低氧誘導因子HIF1α指標的變化；利用QRT-PCR比較三組腎組織以及尿液微囊泡中miR-21的表達情況。 2.分離培養(yǎng)人原代近端腎小管上皮細胞（HPTCs）并鑒定,高糖（33mM）刺激不同時間，通過western blot、SA-β-gal染色、細胞免疫熒光觀察衰老與EMT之間的先后關系。 3.為明確衰老HPTCs是否通過旁分泌含有miR-21微囊泡促進鄰近細胞發(fā)生EMT，限食是否延緩衰老進而抑制微囊泡中miR-21分泌，我們利用白藜蘆醇模擬體外限食，分三步驟：首先高糖(HG)或者HG和白藜蘆醇共刺激HPTCs，觀察細胞衰老情況、以及微囊泡、細胞中miR-21的含量；其次，比較對照組、HG、HG和miR-21inhibitor、miR-21mimics組中細胞及微囊泡中miR-21含量；最后收集前者所述各分組中所分泌微囊泡刺激受體HPTCs，觀察受體細胞EMT發(fā)生。 4.為進一步研究miR-21是否通過靶向調控PPARα，經HIF1α促進腎臟纖維化，我們利用非諾貝特激動PPARα,siRNA技術敲除HIF1α，驗證miR-21-PPARα-HIF1α在腎臟纖維化過程中所起作用。 結果：1.長期限食能明確改善大鼠衰老及纖維化，并降低衰老腎組織或者尿液外泌體中miR-21的表達。PPARα蛋白表達高低順序為YALOCROAL,HIF1α表達高低順序為OALOCRYAL。 2.高糖誘導HPTCs24h后出現SA-β-gal染色陽性，腎小管上皮細胞細胞衰老表型（P53、P21表達升高，P0.05）發(fā)生。而高糖刺激48h后EMT標志物vimentin及α-SMA升高具有統(tǒng)計學意義（p0.05）,72h后E-cadherin下降具有統(tǒng)計學意義,且細胞的免疫熒光顯示，相比0h，高糖刺激72h E-caherin表達明顯下降，α-SMA表達明顯升高因此，明確高糖誘導的HPTCs衰老表型改變早于EMT。 3.收集微囊泡刺激正常HPTCs48h，與control比較，HG、miR-21mimics組細胞及微囊泡中miR-21升高（P0.05），E-cadherin下降，vimentin及α-SMA表達升高（P0.05）;與HG比較， HG+RSV、HG+miR-21inhibitor組細胞及微囊泡中miR-21降低（P0.05），E-cadherin上升，vimentin及α-SMA表達降低（P0.05）。 4.將miR-21mimics或miR negative control轉染HPTCs細胞，檢測PPARα的表達改變。與control、miR negative control組相比，miR-21mimics組的PPARα的蛋白表達下降(p0.05)，而PPARα的mRNA水平沒有變化(p0.05)，表明，miR-21可能通過轉錄后水平對PPARα進行調控。結合既往研究結果，PPARα是miR-21的直接靶基因。 5.將miR-21inhibitor或miR-21mimics轉染HPTCs,24h后換液，miR-21inhibitor組給予HG刺激，48h后觀察各組EMT程度。與control、miR negative control比較，HG、miR-21mimics、HG+miR negative control組，E-cadherin下降，vimentin及α-SMA表達升高（P0.05），HIF1a升高（P0.05）；與HG組比較，HG+miR-21inhibitor組, E-cadherin升高，vimentin及α-SMA表達降低（P0.05），HIF1α降低（P0.05）。 6.選用PPARα激動劑非諾貝特(Fenofibrate)和HG/miR-21mimics共刺激HPTCs。與HG、miR-21mimics組比較，HG+Fenofibrate、miR-21mimics+Fenofibrate組,E-cadherin升高，vimentin及α-SMA表達降低（P0.05），HIF1a降低（P0.05）。 7.通過siRNA-HIF1α抑制HIF1α的活性,與HG、HG+NC組比較，，HG+siHIF1α組E-cadherin升高，vimentin及α-SMA表達降低（P0.05）；與mimics、mimics+NC組比較，mimics+siHIF1α組E-cadherin升高，vimentin及α-SMA表達降低（P0.05）。 結論：1.長期限食可延緩衰老及衰老相關纖維化，并降低衰老腎組織及尿液微囊泡中miR-21表達。 2.白藜蘆醇模擬體外限食可改善高糖誘導的人近端腎小管上皮細胞衰老并阻止其旁分泌含有miR-21微囊泡促進EMT這一過程。 3.MiR-21靶向調控PPARα，通過HIF1α促進人腎近端腎小管上皮細胞EMT發(fā)生。
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借鑒上述低氧所致腎間質纖維化的干預措施,應用于自然衰老模型中改善低氧所致腎間質纖維化是否可行需進一步驗證。圖2.1 缺氧與腎間質纖維化形成閉合回路示意圖2.4 小結衰老伴隨動脈增厚,硬化導致組織灌注降低,腎臟是衰老相關組織損傷的重要靶器官,對缺血缺氧異常敏感；另外腎臟衰老特征為腎間質纖維化,PTCs下降。二者均能引起腎組織低氧,通過HIF依賴或者非HIF依賴途徑影響腎臟纖維化,形成一個閉合循環(huán)回路加速腎功能惡化,最終引起終末期腎臟病(圖2.1)。老年個體血管硬化引起組織低氧及乏氧耐受性降低逐漸引起重視

長期限食延緩腎臟衰老以及腎臟纖維化
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R692

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 孫雪峰;;K/DOQI慢性腎臟病臨床實踐指南只能借鑒 尚須完善[J];中國實用內科雜志;2007年22期

2 蔡廣研;陳香美;師鎖柱;高波;張雪光;王兆霞;;腎小管上皮細胞標志物隨增齡變化及其意義[J];中華老年醫(yī)學雜志;2005年12期

本文編號：2518534