【摘要】：前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤,前列腺癌的預后與前列腺癌的治療方式有很大關(guān)系。雖然包括手術(shù)、內(nèi)分泌治療、放化療和生物治療等傳統(tǒng)的治療手段,對于局限性前列腺癌有很好的療效。但是對于轉(zhuǎn)移性前列腺癌的治療仍然是一個世界難題。因此,探索前列腺癌浸潤及轉(zhuǎn)移的分子機制,尋找新的前列腺癌的治療靶點是目前前列腺癌治療研究的重點。miRNAs是一類內(nèi)生的、長度約19-25個核苷酸的ncRNA,其在細胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。成熟的microRNA通過與mRNA的3’端UTR部分互補識別引起特定的靶mRNA沉默。隨著miRNA調(diào)控基因表達的研究的逐步深入,越來越多的證據(jù)表明,miRNA可以調(diào)控那些與發(fā)育、增殖、凋亡及應激反應相關(guān)的基因,對細胞自身穩(wěn)定和發(fā)育起著重要作用,而且它們的表達異常是人類惡性腫瘤的一個共同特征。miRNA在包括前列腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。但是miRNAs在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用的研究近幾年才剛剛起步。并且,隨著大量新的miRNAs被發(fā)現(xiàn),這些新miRNAs在前列腺癌中的表達也需要被及時檢測與分析。 第一部分前列腺癌差異表達miRNAs的篩選 目的篩選前列腺癌差異表達miRNAs。 方法收集了2010年1月至2012年12月期間手術(shù)切除的前列腺癌標本5例、良性前列腺增生標本3例。首先運用目前最新版的miRNAs生物芯片技術(shù)篩選出前列腺癌的差異表達miRNAs,然后運用RT-PCR方法驗證了芯片結(jié)果。最終選出最有可能與前列腺癌增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA,作為進一步研究的對象。 結(jié)果通過miRNAs芯片分析和RT-PCR驗證,我們共發(fā)現(xiàn)前列腺癌中差異表達miRNA27個,其中表達下調(diào)的miRNA5個(miR-345, miR-145,miR-221, miR-27b和miR-378),表達上調(diào)的miRNA22個,其中miR-182的表達相比良性前列腺增生組織明顯升高。 結(jié)論前列腺癌組織中存在著差異表達miRNAs,其中miR-182在前列腺癌組織中的表達明顯升高。因此,下一步將進一步研究miR-182在前列腺癌中的作用。 第二部分前列腺癌異常表達miRNAs功能研究 目的探討miRNA-182在前列腺癌增殖、凋亡、細胞侵襲方面的作用。 方法用RT-PCR方法檢測人正常前列腺上皮細胞系RWPE-1和四種前列腺癌細胞系(PC-3, DU145,22Rv1和LNCaP)中miRNA-182的表達,為了研究此miRNA在前列腺癌中的作用,我們合成了miRNA mimics和miRNA inhibitros,并通過Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3細胞系,RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miRNA-182表達的變化,MTT檢測細胞轉(zhuǎn)染前后PC-3細胞增殖能力變化；流式細胞術(shù)檢測PC-3細胞周期及凋亡的變化；Transwell檢測PC-3細胞侵襲能力的變化。從而探討異常表達的miRNA-182在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。 結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)miRNA-182在這四種前列腺癌細胞系中的表達均高于正常前列腺上皮細胞系RWPE-1,并且PC-3細胞系中miRNA-182表達上調(diào)最明顯,因此我們選擇PC-3細胞系用于進一步研究。利用Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染miRNA-182mimics和miRNA-182inhibitor及其陰性對照至PC-3細胞系后,RT-PCR檢測結(jié)果顯示miRNA-182mimics和miRNA-182inhibitor能明顯上調(diào)及下調(diào)miRNA-182的表達水平,達到進一步研究的要求。MTT實驗檢測PC-3細胞的增殖能力發(fā)現(xiàn),上調(diào)PC-3細胞中的miRNA-182表達,能明顯提高細胞的增殖能力(P0.05),相反下調(diào)PC-3細胞中miRNA-182表達水平,細胞的增殖能力受到抑制(P0.05)；上調(diào)PC-3細胞中miRNA-182的表達能夠促進細胞從G0-G1期進入S期,相反下調(diào)PC-3細胞中miRNA-182表達,細胞在G0-G1明顯阻滯,并伴隨S期細胞的顯著減少；轉(zhuǎn)染miRNA-182mimics后PC-3細胞的凋亡率明顯低于miRNA-182mimics對照組,相反,轉(zhuǎn)染miRNA-182inhibitor后PC-3細胞的凋亡率要顯著高于miRNA-182inhibitor對照組；將miRNA-182mimics和miRNA-182inhibitor及其對照轉(zhuǎn)染入PC-3細胞后,利用Transwell實驗檢測其侵襲能力的變化,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miRNA-182mimics后細胞的侵襲能力明顯高于對照組,而轉(zhuǎn)染miRNA-182inhibitor細胞的侵襲能力明顯下降。 結(jié)論miR-182在前列腺癌細胞中表達明顯高于正常前列腺上皮細胞,并且前列腺癌PC-3細胞中miR-182表達差異最明顯。miR-182能促使PC-3細胞由G0-G1期進入S期,并通過抑制PC-3細胞的早期凋亡促進細胞的增殖。上調(diào)PC-3細胞中miR-182的表達能促進細胞的侵襲。 第三部分前列腺癌差異表達miRNAs靶基因研究 目的預測miR-182的可能靶基因,并驗證其作用靶點,闡明miR-182的分子作用機制。 方法利用生物信息學技術(shù)如TargetScan, miRBase和PicTar等優(yōu)秀數(shù)據(jù)庫,預測miRNA可能的靶基因,然后利用Western blot和熒光素酶雙報告基因檢測驗證預測靶基因的準確性。從而探明miRNA-182在前列腺癌中可能的分子作用機制。 結(jié)果利用生物信息學技術(shù)預測miR-182的可能靶基因為NDRG1。Western Blot實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miRNA-182mimics組細胞的NDRG1蛋白含量明顯低于miRNA-182mimics-NC組,轉(zhuǎn)染miRNA-182inhibitor組細胞中NDRG1蛋白含量顯著高于miRNA-182inhibitor-NC組；我們成功合成了pmirGLO/NDRG1-UTR載體系統(tǒng),并將pmirGLO/NDRGl-UTR載體與miRNA-182mimics。miRNA-182inhibitor共轉(zhuǎn)染PC-3細胞,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miRNA-182mimics上調(diào)miRNA-182的表達能明顯抑制pmirGLO/NDRG1-UTR的熒光素酶活性,相反,轉(zhuǎn)染miRNA-182inhibitor下調(diào)miRNA-182的表達,pmirGLO/NDRG1-UTR的熒光素酶活性增強。 結(jié)論miR-182是通過直接與NDRG13'UTR區(qū)結(jié)合后下調(diào)NDRG1的表達,從而促進前列腺癌PC-3細胞的增殖及侵襲的。miR-182可以作為一種新的前列腺癌基因治療的靶基因。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.25

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李明;尹玉;曹立宇;徐曉春;張洪福;;微小RNA在前列腺癌組織中的表達及意義[J];中國組織化學與細胞化學雜志;2008年06期

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本文編號：2518142