【摘要】：前列腺癌是老年男性常見(jiàn)的惡性腫瘤,前列腺癌的預(yù)后與前列腺癌的治療方式有很大關(guān)系。雖然包括手術(shù)、內(nèi)分泌治療、放化療和生物治療等傳統(tǒng)的治療手段,對(duì)于局限性前列腺癌有很好的療效。但是對(duì)于轉(zhuǎn)移性前列腺癌的治療仍然是一個(gè)世界難題。因此,探索前列腺癌浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,尋找新的前列腺癌的治療靶點(diǎn)是目前前列腺癌治療研究的重點(diǎn)。miRNAs是一類內(nèi)生的、長(zhǎng)度約19-25個(gè)核苷酸的ncRNA,其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。成熟的microRNA通過(guò)與mRNA的3’端UTR部分互補(bǔ)識(shí)別引起特定的靶mRNA沉默。隨著miRNA調(diào)控基因表達(dá)的研究的逐步深入,越來(lái)越多的證據(jù)表明,miRNA可以調(diào)控那些與發(fā)育、增殖、凋亡及應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因,對(duì)細(xì)胞自身穩(wěn)定和發(fā)育起著重要作用,而且它們的表達(dá)異常是人類惡性腫瘤的一個(gè)共同特征。miRNA在包括前列腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。但是miRNAs在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用的研究近幾年才剛剛起步。并且,隨著大量新的miRNAs被發(fā)現(xiàn),這些新miRNAs在前列腺癌中的表達(dá)也需要被及時(shí)檢測(cè)與分析。 第一部分前列腺癌差異表達(dá)miRNAs的篩選 目的篩選前列腺癌差異表達(dá)miRNAs。 方法收集了2010年1月至2012年12月期間手術(shù)切除的前列腺癌標(biāo)本5例、良性前列腺增生標(biāo)本3例。首先運(yùn)用目前最新版的miRNAs生物芯片技術(shù)篩選出前列腺癌的差異表達(dá)miRNAs,然后運(yùn)用RT-PCR方法驗(yàn)證了芯片結(jié)果。最終選出最有可能與前列腺癌增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA,作為進(jìn)一步研究的對(duì)象。 結(jié)果通過(guò)miRNAs芯片分析和RT-PCR驗(yàn)證,我們共發(fā)現(xiàn)前列腺癌中差異表達(dá)miRNA27個(gè),其中表達(dá)下調(diào)的miRNA5個(gè)(miR-345, miR-145,miR-221, miR-27b和miR-378),表達(dá)上調(diào)的miRNA22個(gè),其中miR-182的表達(dá)相比良性前列腺增生組織明顯升高。 結(jié)論前列腺癌組織中存在著差異表達(dá)miRNAs,其中miR-182在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯升高。因此,下一步將進(jìn)一步研究miR-182在前列腺癌中的作用。 第二部分前列腺癌異常表達(dá)miRNAs功能研究 目的探討miRNA-182在前列腺癌增殖、凋亡、細(xì)胞侵襲方面的作用。 方法用RT-PCR方法檢測(cè)人正常前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1和四種前列腺癌細(xì)胞系(PC-3, DU145,22Rv1和LNCaP)中miRNA-182的表達(dá),為了研究此miRNA在前列腺癌中的作用,我們合成了miRNA mimics和miRNA inhibitros,并通過(guò)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3細(xì)胞系,RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miRNA-182表達(dá)的變化,MTT檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后PC-3細(xì)胞增殖能力變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PC-3細(xì)胞周期及凋亡的變化；Transwell檢測(cè)PC-3細(xì)胞侵襲能力的變化。從而探討異常表達(dá)的miRNA-182在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。 結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)miRNA-182在這四種前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)均高于正常前列腺上皮細(xì)胞系RWPE-1,并且PC-3細(xì)胞系中miRNA-182表達(dá)上調(diào)最明顯,因此我們選擇PC-3細(xì)胞系用于進(jìn)一步研究。利用Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染miRNA-182mimics和miRNA-182inhibitor及其陰性對(duì)照至PC-3細(xì)胞系后,RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示miRNA-182mimics和miRNA-182inhibitor能明顯上調(diào)及下調(diào)miRNA-182的表達(dá)水平,達(dá)到進(jìn)一步研究的要求。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PC-3細(xì)胞的增殖能力發(fā)現(xiàn),上調(diào)PC-3細(xì)胞中的miRNA-182表達(dá),能明顯提高細(xì)胞的增殖能力(P0.05),相反下調(diào)PC-3細(xì)胞中miRNA-182表達(dá)水平,細(xì)胞的增殖能力受到抑制(P0.05)；上調(diào)PC-3細(xì)胞中miRNA-182的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞從G0-G1期進(jìn)入S期,相反下調(diào)PC-3細(xì)胞中miRNA-182表達(dá),細(xì)胞在G0-G1明顯阻滯,并伴隨S期細(xì)胞的顯著減少；轉(zhuǎn)染miRNA-182mimics后PC-3細(xì)胞的凋亡率明顯低于miRNA-182mimics對(duì)照組,相反,轉(zhuǎn)染miRNA-182inhibitor后PC-3細(xì)胞的凋亡率要顯著高于miRNA-182inhibitor對(duì)照組；將miRNA-182mimics和miRNA-182inhibitor及其對(duì)照轉(zhuǎn)染入PC-3細(xì)胞后,利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其侵襲能力的變化,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miRNA-182mimics后細(xì)胞的侵襲能力明顯高于對(duì)照組,而轉(zhuǎn)染miRNA-182inhibitor細(xì)胞的侵襲能力明顯下降。 結(jié)論miR-182在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)明顯高于正常前列腺上皮細(xì)胞,并且前列腺癌PC-3細(xì)胞中miR-182表達(dá)差異最明顯。miR-182能促使PC-3細(xì)胞由G0-G1期進(jìn)入S期,并通過(guò)抑制PC-3細(xì)胞的早期凋亡促進(jìn)細(xì)胞的增殖。上調(diào)PC-3細(xì)胞中miR-182的表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞的侵襲。 第三部分前列腺癌差異表達(dá)miRNAs靶基因研究 目的預(yù)測(cè)miR-182的可能靶基因,并驗(yàn)證其作用靶點(diǎn),闡明miR-182的分子作用機(jī)制。 方法利用生物信息學(xué)技術(shù)如TargetScan, miRBase和PicTar等優(yōu)秀數(shù)據(jù)庫(kù),預(yù)測(cè)miRNA可能的靶基因,然后利用Western blot和熒光素酶雙報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證預(yù)測(cè)靶基因的準(zhǔn)確性。從而探明miRNA-182在前列腺癌中可能的分子作用機(jī)制。 結(jié)果利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)miR-182的可能靶基因?yàn)镹DRG1。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miRNA-182mimics組細(xì)胞的NDRG1蛋白含量明顯低于miRNA-182mimics-NC組,轉(zhuǎn)染miRNA-182inhibitor組細(xì)胞中NDRG1蛋白含量顯著高于miRNA-182inhibitor-NC組；我們成功合成了pmirGLO/NDRG1-UTR載體系統(tǒng),并將pmirGLO/NDRGl-UTR載體與miRNA-182mimics。miRNA-182inhibitor共轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miRNA-182mimics上調(diào)miRNA-182的表達(dá)能明顯抑制pmirGLO/NDRG1-UTR的熒光素酶活性,相反,轉(zhuǎn)染miRNA-182inhibitor下調(diào)miRNA-182的表達(dá),pmirGLO/NDRG1-UTR的熒光素酶活性增強(qiáng)。 結(jié)論miR-182是通過(guò)直接與NDRG13'UTR區(qū)結(jié)合后下調(diào)NDRG1的表達(dá),從而促進(jìn)前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖及侵襲的。miR-182可以作為一種新的前列腺癌基因治療的靶基因。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李明;尹玉;曹立宇;徐曉春;張洪福;;微小RNA在前列腺癌組織中的表達(dá)及意義[J];中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2008年06期

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本文編號(hào)：2518142