【摘要】：背景糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)微血管病變所產(chǎn)生的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。糖尿病腎病時,系膜細(xì)胞過度增殖并合成大量細(xì)胞外基質(zhì)從而促進(jìn)腎小球硬化,加快病情進(jìn)展。系膜細(xì)胞改變的原因在于各種功能蛋白表達(dá)異常。新近的研究發(fā)現(xiàn),mRNA穩(wěn)定性對于蛋白表達(dá)的調(diào)控具有重要意義。HuR是研究最為廣泛的可以調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性的蛋白,主要作用于多種靶基因mRNA 3'UTR的ARE區(qū)�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其在腎小球系膜細(xì)胞表達(dá),且HuR表達(dá)或活性異常與多種炎癥因子誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞形態(tài)或者功能改變有關(guān)。但HuR在高糖環(huán)境下是否對系膜細(xì)胞形態(tài)與功能有影響尚不清楚。固有免疫系統(tǒng)的激活及后續(xù)炎癥介質(zhì)的釋放在DN的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。固有免疫系統(tǒng)通過模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)來識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)或損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern, DAMP)。NLR (NOD-like receptors)是PRR中重要的一個亞家族,它可以在多種腎臟疾病中活化免疫細(xì)胞和腎臟固有細(xì)胞,誘導(dǎo)炎癥因子的釋放并導(dǎo)致組織損傷。我們實驗室最近的研究已經(jīng)證實,NLR家族中的重要成員NOD2在糖尿病腎病患者腎活檢組織標(biāo)本中表達(dá)上調(diào),Nod2基因敲除可明顯改善小鼠的糖尿病性腎損傷,但NOD2在高糖條件下表達(dá)上調(diào)的機制仍然未知。通過基因序列分析,我們發(fā)現(xiàn)NOD2 mRNA的3'UTR端中含有潛在的可被HuR識別的ARE序列,且不同物種間高度保守。這強烈提示NOD2可能是HuR的潛在調(diào)控靶點。因此,探討HuR與NOD2轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)系是本課題擬解決的一個關(guān)鍵問題。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是廣泛存在于各種細(xì)胞、組織中的一種自由基。以NOX4為主的NADPH氧化酶是腎臟中重要的活性氧來源。已有研究表明,ROS可調(diào)控HuR的核質(zhì)穿梭過程。但NOX4對HuR的作用及其與糖尿病腎病慢性炎癥的關(guān)系仍不清楚。因此,明確糖尿病腎病狀態(tài)下NOX4產(chǎn)生的活性氧對HuR的調(diào)控及由此造成的固有免疫、炎癥因子的改變對糖尿病腎病發(fā)病機制的理解具有重要意義。研究目的1.確定HuR在糖尿病腎病中的表達(dá)及作用,探討以HuR為靶點的基因干預(yù)對糖尿病腎病的治療作用。2.明確HuR是否參與NOD2 mRNA穩(wěn)定性調(diào)控及相關(guān)機制。3.探討NOX4介導(dǎo)的氧化應(yīng)激對HuR及NOD2的調(diào)控作用。研究方法1 RNA結(jié)合蛋白HuR在糖尿病腎病中的作用及機制1.1 HuR在人腎組織中的表達(dá)及其與DN患者蛋白尿的關(guān)系從山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院及山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室獲取正常、糖尿病腎病及糖尿病非腎病組織樣本。免疫組化染色觀察HuR表達(dá)。統(tǒng)計糖尿病腎病患者24h尿蛋白量,分析患者腎組織中HuR表達(dá)量與尿蛋白量的相關(guān)性。1.2干擾腎皮質(zhì)HuR表達(dá)對大鼠糖尿病腎病的影響大鼠分組及造模：雄性SD大鼠,隨機分為正常組,糖尿病腎病組,scramble對照組,shRNA對照組,糖尿病腎病+scramble組,糖尿病腎病+shRNA組。每組10只。采用單腎切除加鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)注射的方法誘導(dǎo)糖尿病腎病,同時,采用腎實質(zhì)內(nèi)注射的方法導(dǎo)入含scramble或shRNA-HuR序列的慢病毒。喂養(yǎng)12周后通過監(jiān)測空腹血糖、24h尿蛋白量等指標(biāo)確定糖尿病腎病造模是否成功。免疫組化檢測HuR在糖尿病腎病腎皮質(zhì)中的表達(dá)變化。PAS染色觀察干擾HuR后對糖尿病腎病腎小球形態(tài)的影響,ELISA檢測各組大鼠腎皮質(zhì)炎癥因子的變化。1.3高糖刺激對RMC中HuR表達(dá)及核質(zhì)穿梭的影響體外培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞(rat mesangial cell,RMC),使用不同時間及不同濃度梯度的葡萄糖刺激細(xì)胞,分別提取細(xì)胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞核蛋白和總蛋白。Westernblot檢測不同細(xì)胞組分中HuR表達(dá)量。細(xì)胞免疫熒光染色觀察HuR在細(xì)胞中的定位及分布變化。在葡萄糖刺激前加入終濃度為10μg/mL的放線菌酮以終止總蛋白合成,提取不同細(xì)胞組份,Western blot驗證HuR的核質(zhì)穿梭。2 HuR對固有免疫受體NOD2 mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控2.1 NOD2在人腎組織中的表達(dá)及其與HuR的關(guān)系免疫組化染色觀察NOD2在不同人腎組織標(biāo)本中的表達(dá)情況。分析其與HuR表達(dá)是否存在相關(guān)性。2.2糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)中干擾HuR表達(dá)對NOD2的影響免疫組化和Western blot檢測HuR及NOD2在糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)中表達(dá)變化。Western blot及組織免疫熒光觀察干擾HuR對糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)中NOD2的影響。2.3系膜細(xì)胞中HuR對NOD2表達(dá)的影響Western blot及RT-PCR檢測高糖刺激的系膜細(xì)胞中NOD2蛋白及mRNA變化。使用慢病毒包被的shRNA-HuR感染細(xì)胞,Western blot檢測HuR干擾效率以及干擾HuR后NOD2表達(dá)量的變化。2.4 HuR對NOD2表達(dá)調(diào)控的機制使用放線菌素D終止細(xì)胞內(nèi)mRNA合成后,檢測不同時間點NOD2 mRNA在細(xì)胞內(nèi)的剩余量,觀察干擾HuR表達(dá)對高糖刺激下NOD2 mRNA降解速率的影響。尋找NOD2 mRNA 3'UTR區(qū)中HuR的潛在結(jié)合區(qū)域,并通過RNA-EMSA實驗驗證NOD2 3'UTR不同ARE序列與HuR的結(jié)合效率,明確HuR與NOD2mRNA的結(jié)合位點。為進(jìn)一步證明3'UTR對NOD2 mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)作用,我們將其整合到雙熒光素酶報告質(zhì)粒中,轉(zhuǎn)染系膜細(xì)胞,觀察熒光素酶表達(dá)的強弱變化。加入高糖刺激系膜細(xì)胞后再次觀察熒光素酶表達(dá),分析高糖對3'UTR功能的影響。3 NADPH氧化酶對HuR-NOD2通路的調(diào)控3.1糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)氧化應(yīng)激水平表征Western blot觀察不同NOX蛋白在大鼠腎皮質(zhì)中的表達(dá)情況。DHE檢測超氧化物陰離子含量,Amplex紅檢測雙氧水濃度。3.2系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)Western blot檢測高糖刺激的RMC中NOX4表達(dá)。DHE檢測超氧化物陰離子含量,Amplex紅檢測雙氧水濃度。3.3 NOX4在HuR調(diào)控的NOD2表達(dá)中的作用使用siRNA干擾NOX4表達(dá)。Western blot檢測干擾效率。高糖刺激轉(zhuǎn)染后的系膜細(xì)胞,提取不同細(xì)胞組份,Western blot檢測HuR及NOD2的表達(dá)情況。免疫熒光觀察干擾NOX4后HuR在細(xì)胞內(nèi)分布的變化。放線菌素D終止mRNA合成,RT-PCR檢測干擾NOX4后NOD2 mRNA降解速率的變化。體外培養(yǎng)腎細(xì)胞NRK-52E, Western blot觀察葡萄糖刺激后NOX4及HuR的表達(dá)。結(jié)果1 RNA結(jié)合蛋白HuR在糖尿病腎病中的作用及機制1.1 HuR在人腎組織中的表達(dá)及其與DN患者蛋白尿的關(guān)系免疫組化染色可見糖尿病腎病患者腎小球中HuR表達(dá)量明顯上調(diào)。糖尿病腎病患者中,HuR表達(dá)量與患者蛋白尿水平呈正相關(guān)。1.2干擾腎皮質(zhì)HuR表達(dá)對大鼠糖尿病腎病的影響免疫組化顯示糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)中HuR表達(dá)升高,與腎活檢標(biāo)本結(jié)果一致。干擾HuR的糖尿病腎病大鼠損傷明顯較糖尿病腎病大鼠減輕。炎性因子的生成量也減少。1.3高糖刺激對RMC中HuR表達(dá)及核質(zhì)穿梭的影響Western blot顯示高糖刺激可使HuR在細(xì)胞質(zhì)及總蛋白中表達(dá)量均上升,且呈濃度依賴性和時間依賴性。細(xì)胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),高糖使HuR在細(xì)胞核中的染色降低,而細(xì)胞質(zhì)中染色明顯增強。培養(yǎng)基加入放線菌酮終止蛋白合成后,Western blot依然能檢測到HuR在細(xì)胞質(zhì)中的聚集。2 HuR對固有免疫受體NOD2 mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控2.1 NOD2在人腎組織中的表達(dá)及其與HuR的關(guān)系免疫組化染色可見糖尿病腎病腎小球中NOD2表達(dá)量明顯上調(diào)。統(tǒng)計顯示腎小球HuR與NOD2蛋白水平呈正相關(guān)。2.2糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)中干擾HuR表達(dá)對NOD2的影響Western blot和免疫組化結(jié)果表明糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)中HuR和NOD2表達(dá)水平均有升高,與腎活檢標(biāo)本結(jié)果一致。干擾大鼠腎皮質(zhì)HuR表達(dá)后NOD2高表達(dá)受到抑制。2.3系膜細(xì)胞中HuR對NOD2表達(dá)的影響高糖刺激可時間依賴性地增加NOD2 mRNA和蛋白質(zhì)的量。干擾HuR后,NOD2高表達(dá)能夠被顯著抑制。2.4 HuR對NOD2表達(dá)調(diào)控的機制放線菌素D(Act D)阻斷mRNA轉(zhuǎn)錄后RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn),高糖能延長NOD2mRNA半衰期,而干擾HuR后能顯著抑制高糖誘導(dǎo)的半衰期延長。檢索發(fā)現(xiàn)大鼠NOD2 3'UTR含有四個ARE區(qū)。序列比對顯示ARE4在不同物種間高度保守。RNA-EMSA實驗發(fā)現(xiàn)僅NOD2-ARE4探針能夠與腎組織提取物相互結(jié)合形成復(fù)合物。高糖刺激可濃度依賴性地增加RMC細(xì)胞質(zhì)提取物與NOD2-ARE4形成復(fù)合物的能力。且抗HuR抗體可使復(fù)合物發(fā)生超遷移現(xiàn)象,證明HuR參與了復(fù)合物的形成。以重組HuR蛋白作陽性對照的實驗進(jìn)一步確認(rèn)了HuR和NOD2-ARE4的相互作用。雙熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn),相對于對照組,含有NOD2 3'UTR的質(zhì)粒組熒光素酶活性顯著降低,而高糖刺激后能夠明顯抑制其降低。以上結(jié)果說明HuR可結(jié)合于NOD2 ARE4并增加其mRNA穩(wěn)定性。3 NADPH氧化酶對HuR-NOD2通路的調(diào)控3.1大鼠腎皮質(zhì)氧化應(yīng)激水平表征NOX4在糖尿病腎病腎皮質(zhì)中表達(dá)上升明顯,同時,O2-和H2O2水平也明顯升高。3.2系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)高糖刺激可以增加RMC中NOX4的表達(dá)量并同時增加O2-和H2O2水平。3.3 NOX4在HuR調(diào)控的NOD2表達(dá)中的作用基因沉默NOX4可顯著降低RMC中高糖誘導(dǎo)的HuR高表達(dá)和其在細(xì)胞質(zhì)中的聚集。細(xì)胞免疫熒光也顯示基因沉默NOX4后可減弱高糖引起的HuR核質(zhì)轉(zhuǎn)移。另外,干擾NOX4表達(dá)能夠顯著抑制高糖誘導(dǎo)的NOD2高表達(dá)及mRNA半衰期的延長。NRK-52E細(xì)胞中也觀察到了NOX4和HuR表達(dá)的上調(diào)。提示氧化應(yīng)激介導(dǎo)的HuR功能改變可能是腎實質(zhì)細(xì)胞中的共同機制。結(jié)論1.高糖刺激下系膜細(xì)胞內(nèi)以NOX4為主的NADPH氧化酶活性升高,活性氧生成增多,誘導(dǎo)HuR表達(dá)且向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集進(jìn)而活化。2.細(xì)胞質(zhì)內(nèi)HuR與NOD2 mRNA的3'UTR(主要為ARE4)結(jié)合,使其穩(wěn)定性增加,并導(dǎo)致其蛋白表達(dá)上調(diào)。3.NOD2介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)激活導(dǎo)致腎皮質(zhì)炎癥因子增多,系膜細(xì)胞增生,基質(zhì)沉積,腎臟損傷加重。4.干擾HuR后,NOD2蛋白水平降低,糖尿病腎病大鼠的腎損傷明顯減輕,提示以HuR為靶點的基因干預(yù)對糖尿病腎病有潛在治療作用。創(chuàng)新性本課題首次發(fā)現(xiàn)在大鼠系膜細(xì)胞中,高糖刺激通過NOX4促使HuR向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集實現(xiàn)對NOD2 mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控。且糖尿病腎病大鼠的體內(nèi)實驗證明了以HuR為靶點的基因干預(yù)可緩解糖尿病腎病腎損傷,這為臨床治療糖尿病腎病提供了新思路。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R692.9
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本文編號：2473096