【摘要】：目的糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)最主要的微血管并發(fā)癥之一。目前關(guān)于DN機制的研究涉及諸多方面,其中腎小球屏障功能的損害是導(dǎo)致蛋白尿的直接原因,而腎小球內(nèi)皮細胞則是腎小球濾過膜的重要組成部分。本研究選用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)尾靜脈注射建立T2DM和DN大鼠模型為研究對象,予雷公藤多苷(TWP)聯(lián)合小檗堿(BBR)分別于正常白蛋白尿期和微量白蛋白尿期進行干預(yù),探討其對腎小球內(nèi)皮細胞相關(guān)因子單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)和血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)的影響。方法清潔級雄性SD大鼠260只,隨機選取20只分別作為預(yù)防組正常對照組(PNC組,n=10)、治療組正常對照組(TNC組,n=10),以常規(guī)飼料喂養(yǎng)。其余240只大鼠以高糖高脂飼料喂養(yǎng),8周后予STZ(30mg/kg)尾靜脈注射建立T2DM模型。將成模大鼠隨機分為預(yù)防(P)組和治療(T)組,各120只大鼠。預(yù)防組分為模型對照(PDM)組、雷公藤多苷單藥組、小檗堿單藥(PB,BBR 150mg/kg·d)組和雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿組。其中雷公藤多苷單藥組根據(jù)應(yīng)用雷公藤多苷的劑量進一步分為低(TWP1mg/kg·d)、中(TWP3mg/kg·d)、高(TWP6mg/kg·d)劑量(PTL、PTM、PTH)組;雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿組根據(jù)應(yīng)用雷公藤多苷的劑量進一步分為低劑量雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿(PTBL,TWP1mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)組、中劑量雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿(PTBM,TWP3mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)組、高劑量雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿(PTBH,TWP6mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)組,每組各15只,成模后即開始灌胃,正常對照(PNC)組和模型對照(PDM)組以等量蒸餾水(2ml)灌胃,灌胃8周末處死取材。治療組分為模型對照(TDM)組、雷公藤多苷單藥組、小檗堿單藥(TB,BBR 150mg/kg·d)組,雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿組。其中雷公藤多苷單藥組根據(jù)應(yīng)用雷公藤多苷的劑量進一步分為低(TWP 3mg/kg·d)、中(TWP 6mg/kg·d)、高(TWP 9mg/kg·d)劑量(TTL、TTM、TTH)組;雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿組根據(jù)應(yīng)用雷公藤多苷的劑量進一步分為低劑量雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿(TTBL,TWP3mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)組、中劑量雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿(TTBM,TWP6mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)組、高劑量雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿(TTBH,TWP 9mg/kg·d+ BBR 150mg/kg·d)組,每組各15只,成模6周后開始灌胃,正常對照(TNC)組和模型對照(TDM)組以等量蒸餾水(2ml)灌胃,灌胃8周末處死取材。實驗過程中記錄大鼠體重(BW)、血糖、24小時尿微量白蛋白(UMA)變化;處死取材時記錄BW、腎重(KW);留取血標本檢測血糖、肝腎功能、血脂、血常規(guī);采用ELISA法檢測大鼠血清中MCP-1、VCAM-1水平;留取腎組織標本,電鏡觀察大鼠腎組織腎小球濾過膜超微結(jié)構(gòu)改變,分別應(yīng)用RT-PCR法、Western Blotting法和免疫組化法檢測大鼠腎組織中MCP-1和VCAM-1的mRNA和蛋白的表達。結(jié)果1.高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周后大鼠血脂、胰島素水平和HOMA-IR、HOMA-β指數(shù)較常規(guī)飼料組明顯升高(P0.05);STZ注射后,高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠血糖明顯升高,體重明顯減輕,同時伴有多飲、多尿、多食等癥狀,成模6周后實驗大鼠24h尿微量白蛋白明顯升高。2.一般指標:①體重、血糖:與PNC、TNC組相比,預(yù)防和治療各組大鼠造模后血糖明顯升高(P0.05),體重明顯下降(P0.05),雷公藤多苷和小檗堿灌胃對大鼠體重、血糖未見顯著影響(P0.05);②腎重指數(shù)(KW/BW):與PNC、TNC組相比,PDM和TDM組大鼠KW/BW均明顯升高(P0.05),預(yù)防組大鼠經(jīng)雷公藤多苷和小檗堿灌胃后KW/BW均有所下降(P0.05),以PTH組下降最為明顯;治療組大鼠經(jīng)雷公藤多苷和小檗堿灌胃后,TTH組、TB組及雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿各組(TTBL、TTBM、TTBH)大鼠KW/BW下降有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);③血脂:與PNC、TNC組相比,糖尿病各組大鼠甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)水平顯著升高(P0.05),雷公藤多苷和小檗堿灌胃后未見顯著影響(P0.05):④肝、腎功能、血常規(guī):大鼠肝、腎功能和血常規(guī)在各組間均無明顯差異(P0.05),雷公藤多苷和小檗堿灌胃后未見顯著影響(P0.05)。3.24h尿微量白蛋白(UMA):①預(yù)防組:與PNC組相比,糖尿病各組大鼠UMA水平明顯升高(P0.05);與PDM組相比,雷公藤多苷單藥各組、小檗堿單藥組和雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿各組大鼠UMA水平明顯降低(P0.05),且呈劑量依賴性;②治療組:與TNC組相比,糖尿病各組大鼠UMA水平明顯升高(P0.05);與TDM組相比,雷公藤多苷單藥各組和雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿各組大鼠UMA水平明顯降低(P0.05),呈劑量依賴性。4.電鏡觀察腎小球濾過膜變化:正常對照組大鼠腎小球內(nèi)皮細胞數(shù)量、形態(tài)、毛細血管腔的大小和內(nèi)容物未見明顯異常。糖尿病各組大鼠可見腎小球內(nèi)皮細胞增生腫脹呈擁塞狀,向管腔內(nèi)突出等早期DN腎小球內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)改變,治療組較預(yù)防組相比更為嚴重。雷公藤多苷單藥各組、小檗堿組和雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿各組上述病理性超微結(jié)構(gòu)均有所改善。5.采用ELISA法檢測大鼠血清中MCP-1、VCAM-1水平:①預(yù)防組:與PNC組相比,糖尿病各組大鼠血清MCP-1、VCAM-1水平明顯升高(P0.05);與PDM組相比,PTH、PTBM和PTBH組大鼠血清MCP-1、VCAM-1水平顯著下降(P0.05);②治療組:與TNC組相比,糖尿病各組大鼠血清MCP-1、VCAM-1水平明顯升高(P0.05);與TDM組相比,大鼠血清MCP-1水平以TTH、TTBL、TTBM和TTBH組下降明顯(P0.05),而大鼠血清VCAM-1水平在TTM、TTH、TTBL、TTBM和TTBH組顯著下降(P0.05)。6.應(yīng)用RT-PCR法檢測大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1mRNA的表達:①預(yù)防組:與PNC組相比,糖尿病各組大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1mRNA表達明顯升高(P0.05);與PDM組相比,雷公藤多苷單藥各組、小檗堿單藥組和雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿各組大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1mRNA表達明顯降低(P0.05),且呈劑量依賴性;②治療組:與TNC組相比,糖尿病各組大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1mRNA表達明顯升高(P0.05);與TDM組相比,雷公藤多苷單藥各組和雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿各組大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1mRNA表達明顯降低(P0.05),呈劑量依賴性。7.應(yīng)用WesternBlotting法檢測大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1蛋白的表達:①預(yù)防組:與PNC組相比,糖尿病各組大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1蛋白表達明顯升高(P0.05);與PDM組相比,雷公藤多苷單藥各組、小檗堿單藥組和雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿各組大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1蛋白表達明顯降低(P0.05),且呈劑量依賴性;②治療組:與TNC組相比,糖尿病各組大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1蛋白表達明顯升高(P0.05);與TDM組相比,雷公藤多苷單藥各組和雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿各組大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1蛋白表達明顯降低(P0.05),呈劑量依賴性。8.應(yīng)用免疫組化法檢測大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1蛋白的表達:與PNC、TNC組相比,糖尿病各組大鼠腎小球中均可見標記的MCP-1、VCAM-1細胞浸潤(P0.05);雷公藤多苷灌胃后大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1表達明顯降低(P0.05),中、高劑量雷公藤多苷(PTM、PTH、TTM、TTH)組下降明顯;應(yīng)用小檗堿灌胃后,在預(yù)防組觀察到小檗堿作用明顯(P0.05),而在治療組單純小檗堿灌胃效果不明顯(P0.05):雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿各組大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1表達明顯降低(P0.05),中、高劑量雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿(PTBM、PTBH、TTBM和TTBH)組效果顯著。結(jié)論1.通過高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ,成功制備T2DM和DN模型。2.電鏡結(jié)果顯示DN大鼠腎小球內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)改變,同時大鼠腎組織中MCP-1、VCAM-1的mRNA水平和蛋白的表達明顯升高,提示腎小球內(nèi)皮細胞相關(guān)細胞因子和黏附分子的改變與DN發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。3.雷公藤多苷單藥、小檗堿單藥或二者聯(lián)合應(yīng)用可降低預(yù)防組大鼠尿蛋白水平,延緩DN發(fā)生,雷公藤多苷單藥或聯(lián)合小檗堿干預(yù)可降低治療組大鼠尿蛋白水平,減慢DN發(fā)展,而單獨應(yīng)用小檗堿對治療組大鼠效果不明顯。且實驗大鼠應(yīng)用各劑量雷公藤多苷及小檗堿灌胃后均未觀察到明顯的肝腎損害和外周血細胞減少,安全性良好。4.應(yīng)用雷公藤多苷和小檗堿干預(yù)可減少以MCP-1、VCAM-1為代表的腎小球內(nèi)皮細胞相關(guān)的細胞因子和黏附分子的表達,減輕內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng),修復(fù)濾過膜結(jié)構(gòu),延緩DN發(fā)生,減慢DN發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R587.2;R692.9

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本文編號：2453739