【摘要】：【目的】本課題觀察甲烷飽和鹽水對于小鼠腎缺血再灌注損傷是否存在保護作用。并初步探討其是否通過降低氧化應激、降低巨噬細胞向腎組織的趨化、抑制巨噬細胞分泌細胞因子、降低炎癥反應以及抑制腎小管上皮細胞凋亡來發(fā)揮其保護作用�！痉椒ā�1.48只小鼠采用隨機數字表法隨機分為六組:假手術組(Sham組)、甲烷飽和鹽水組(MS組)、腎缺血再灌注組(RIR組)、腎缺血再灌注甲烷飽和鹽水10ml/kg組(RIR+MS 10組)、腎缺血再灌注甲烷飽和鹽水20ml/kg組(RIR+MS 20組)、腎缺血再灌注甲烷飽和鹽水40mg/kg組(RIR+MS 40組),每組8只。其中RIR組和RIR+MS各劑量組小鼠采用雙側腎蒂夾閉45min的方法建立腎缺血再灌注模型。Sham組和MS組僅剖腹,不做其它操作。RIR+MS 10組、RIR+MS 20組、RIR+MS 40組和MS組在關腹后即刻分別經腹腔注射甲烷飽和鹽水10ml/kg、20ml/kg、40ml/kg和20ml/kg。Sham組和RIR組在同樣時間分別腹腔注射生理鹽水20ml/kg。再灌注(或關腹后)24h取材,檢測血清肌酐和尿素氮水平,同時取腎臟行病理學檢查。2.24只小鼠采用隨機數字表法隨機分為四組:Sham組、MS組、RIR組和RIR+MS組,每組6只。每組處理方法同前,選擇20 ml/kg作為本部分實驗的給藥劑量。再灌注后24h取腎組織檢測MDA濃度及SOD、CAT和MPO活性水平。3.32只小鼠采用隨機數字表法隨機分為四組:Sham組、MS組、RIR組和RIR+MS組,每組8只。每組處理方法同前,選擇20 ml/kg作為本部分實驗的給藥劑量。再灌注后24h取腎組織測定MCP-1 mRNA的表達水平。同時取腎臟制備單細胞懸液,流式細胞術檢測巨噬細胞數量。ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10濃度。4.在體實驗中,24只小鼠采用隨機數字表法隨機分為四組:Sham組、MS組、RIR組和RIR+MS組,每組6只。每組處理方法同前,選擇20 ml/kg作為本部分實驗的給藥劑量。再灌注后24h取腎臟進行TUNEL染色。離體實驗中,將HK-2細胞也分為4組:對照組(Sham組)、甲烷飽和鹽水組(MS組)、缺氧復氧模型組(HR組)和缺氧復氧模型甲烷飽和鹽水組(HR+MS組)。復氧24h后收集細胞使用Western blot法檢測caspase 3蛋白表達水平。【結果】1.再灌注后24h,與Sham組比較,MS組、RIR+MS 20組及RIR+MS 40組小鼠血肌酐水平均無明顯變化(P均大于0.05),而RIR組和RIR+MS 10組小鼠血肌酐水平則顯著升高(p值均小于0.01);與rir組比較,rir+ms10組、rir+ms20組及rir+ms40組小鼠血肌酐水平均明顯降低(p均小于0.01)。再灌注24h,與sham組比較,ms組小鼠血清尿素氮水平無明顯變化(p0.05),rir組、rir+ms10組、rir+ms20組及rir+ms40組小鼠血清尿素氮水平則顯著升高(p均小于0.05);而與rir組比較,rir+ms10組、rir+ms20組及rir+ms40組小鼠血清尿素氮水平均顯著降低(p均小于0.01)。腎臟he染色顯示,sham組和ms組小鼠腎組織中腎小管上皮細胞排列整齊,刷狀緣完整,基底膜完整,腎小管中無管型無管腔堵塞;rir組則可見腎小管上皮細胞片狀和灶狀壞死,從基底膜上脫落,腎小管中可見管型及管腔堵塞,病變嚴重部位可見腎小管基底膜破壞;與rir組比較,rir+ms各劑量組腎小管上皮細胞片狀和灶狀壞死減少,病變程度較減輕,腎小管中管型少見,腎小管基底膜完整性較好。與rir+ms10組比較,rir+ms20組和rir+ms40組改善程度更為顯著。而rir+ms20組和rir+ms40組之間比較則差別不明顯。2.再灌注后24h,與sham組比較,ms組小鼠腎組織中mda濃度、sod活性、cat活性及mpo活性水平均無明顯變化;而rir組小鼠mda濃度顯著升高,sod活性和cat活性顯著降低,mpo活性顯著升高(p均小于0.01);rir+ms組小鼠腎組織mda水平與mpo活性均升高(p均小于0.05),而sod活性和cat活性無明顯變化(p均大于0.05)。與rir組比較,rir+ms組小鼠腎組織mda水平明顯降低,sod活性和cat活性顯著升高,mpo活性顯著降低(p均小于0.01)。3.再灌注后24h時,與sham組比較,ms組小鼠腎組織中mcp-1的表達無明顯變化(p0.05),rir組和rir+ms組小鼠腎組織中mcp-1表達則顯著升高(p值均小于0.01);與rir組比較,rir+ms組小鼠腎組織中mcp-1表達顯著降低(p0.01)。而巨噬細胞計數結果顯示,與sham組比較,ms組和rir+ms組小鼠腎組織中巨噬細胞數量均無明顯變化(p均大于0.05),rir組小鼠腎組織中巨噬細胞數量則顯著升高(p0.01);與rir組比較,rir+ms組小鼠腎組織中巨噬細胞數量明顯降低(p0.01)。血清炎癥因子檢測結果顯示,與sham組比較,ms組小鼠血清tnf-α和il-6無顯著變化,il-10水平升高(p0.01),rir組和rir+ms組小鼠血清tnf-α、il-6和il-10水平則顯著升高(p均小于0.01);與rir組比較,rir+ms組小鼠血清tnf-α和il-6水平明顯降低,il-10水平顯著升高(p均小于0.05)。而各組間il-1β水平無明顯變化(p0.05)。4.再灌注后24h,與sham組小鼠比較,rir組小鼠腎臟tunel染色顯示腎組織中凋亡細胞顯著增多,而rir+ms組小鼠腎臟凋亡細胞數量較rir組顯著減少。而hk-2體外實驗顯示建立體外缺氧復氧模型后,caspase3表達顯著上調;而給予甲烷飽和鹽水處理后,caspase 3表達與HR組比較顯著下調�！窘Y論】在關腹后即刻腹腔注射MS可顯著減輕小鼠腎缺血再灌注損傷。其保護作用可能與其抗氧化應激、抑制巨噬細胞向缺血再灌注后的腎臟趨化、減輕機體炎癥反應以及減少腎小管上皮細胞凋亡有關。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R692.5

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本文編號：2449734