【摘要】：背景： 糖尿病腎�。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，已經成為發(fā)達國家導致終末期腎臟�。╡nd-stage renal disease，ESRD）的主要原因。蛋白尿和腎小球肥大是DN最重要的兩個特征。多種機制包括腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）的激活參與了DN蛋白尿的形成。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是RAS中最重要的效應分子，研究顯示大部分已知的AngⅡ效應是由AngⅡ1型（AngⅡ type1，AT1）受體介導的。大量的臨床和動物實驗表明，AT1受體拮抗劑（AT1receptor blocker，ARB）可減輕DN腎損傷、降低尿蛋白水平，但其作用機制目前還不是十分清楚。 脂氧化酶（lipoxygenase，LO）是一類多元不飽和脂肪酸的氧化酶。根據其氧化花生四烯酸時氧原子的插入位置不同，可分為5-、8-、12-和15-LO。12-LO以花生四烯酸為基質生成12（S）-氫氧化二十碳四烯酸[12(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid，12(S)-HETE]。目前已證實12-LO及其作用產物12(S)-HETE主要通過氧化應激和炎癥反應參與DN的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)用AngⅡ刺激腎小球細胞可激活12-LO活性，且ARB能降低肥胖Zucker大鼠腎組織內12-LO活性并延緩蛋白尿進展，然而DN時通過抑制AngⅡ-12-LO作用途徑延緩蛋白尿的機制尚不完全清楚。 足細胞構成腎小球濾過的第三道屏障，研究顯示足細胞數(shù)目減少及裂孔蛋白功能缺陷是DN蛋白尿形成的重要原因。AngⅡ促進蛋白尿形成的機制與足細胞的上皮-間充質細胞轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和裂孔蛋白nephrin和P-cadherin表達減少有關。研究證實12-LO代謝產物12(S)-HETE亦能減少腎小球內P-cadherin表達。因此，本研究設想DN時用ARB阻斷AngⅡ作用，可抑制12-LO活性，進而影響足細胞的EMT過程并上調nephrin和P-cadherin蛋白表達，減輕蛋白尿。 胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是2型糖尿病的重要特征，可通過多種機制參與DN蛋白尿的形成。研究顯示12-LO參與2型DN時白蛋白尿的形成，而與1型DN時白蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展關系不大。眾所周知，1型和2型糖尿病的重要區(qū)別是IR，因此，我們設想12-LO可能通過影響IR作用于蛋白尿的發(fā)生和發(fā)展。 方法： 1.用10-7mol/L AngⅡ處理足細胞24h，收集細胞上清液檢測12(S)-HETE水平。 2.采用皮下包埋的微型滲透泵給大鼠持續(xù)恒速注入Ang Ⅱ（400ng Kg-1min-1），對照組大鼠泵注乙醇胺。14天后處死大鼠，提取腎小球，檢測腎小球內12(S)-HETE水平及nephrin和P-cadherin蛋白表達。 3.采用皮下包埋的微型滲透泵給大鼠持續(xù)恒速注入12(S)-HETE（1mg Kg-1d-1），對照組大鼠泵注乙醇胺。7天后處死大鼠，提取腎小球，檢測腎小球內AngⅡ水平及nephrin和P-cadherin蛋白表達。 4.采用高脂飲食結合小劑量鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）注射的方法誘導2型糖尿病大鼠模型，模型成功后將大鼠隨機分為2組：DN組和ARB組（洛沙坦灌胃，5mg Kg-1d-1）。以規(guī)律正常飲食大鼠作為對照組。6周后處死大鼠，收集24h尿液，提取腎臟，，分離腎小球。過碘酸-希夫氏（periodic acid schiff，PAS）染色觀察腎組織結構，并檢測腎小球內12(S)-HETE含量，nephrin、P-cadherin、足細胞上皮型標志蛋白及間充質標志蛋白表達。 5.野生型和12-LO基因敲除鼠，分為四組：野生型對照組（WT），12-LO基因敲除組（LOKO），野生型糖尿病組（WT+STZ）和12-LO基因敲除糖尿病組（LOKO+STZ）。采用一次性腹腔注射大劑量STZ法誘導1型糖尿病模型。實驗期間連續(xù)監(jiān)測小鼠血糖，并于實驗結束前留取24h尿測尿白蛋白。 6.采用高脂飲食結合小劑量STZ誘導2型糖尿病模型，大鼠模型成功后隨機分為2組：DN組和CDC（cinnamyl-3,4-dihydroxy-α-cynanocinnamate，12-LO抑制劑）組（CDC后腿皮下注射，8mg Kg-1d-1，3次/周）。以規(guī)律正常飲食大鼠作為對照組。8周后處死大鼠，收集24h尿液及血液，并檢測空腹胰島素水平。 采用系列過篩法分離腎小球，并根據篩網孔徑將腎小球分為大腎小球（125μm）和小腎小球（75μm）。ELISA檢測AngⅡ、12(S)-HETE及尿白蛋白水平，放射免疫法檢測空腹胰島素水平，Western blot、RT-PCR檢測相關蛋白表達，PAS染色觀察腎組織結構。 結果： 1. AngⅡ直接刺激誘導足細胞及大鼠腎小球內12(S)-HETE含量增加（P0.01）。用微型滲透泵給大鼠皮下注射12(S)-HETE后，大鼠腎小球內AngⅡ水平明顯升高（P0.01）。 2. AngⅡ和12(S)-HETE刺激明顯減少大鼠大腎小球內nephrin蛋白表達（P0.05），增加大鼠小腎小球內nephrin蛋白表達（P0.05）。皮下注射AngⅡ和12(S)-HETE后，大鼠大、小腎小球內P-cadherin蛋白表達均減少（P0.05）。 3．與對照組相比，DN組大鼠血糖、腎重/體重及24h尿白蛋白明顯增加（P0.01），同時伴有腎小球肥大和細胞外基質積聚，洛沙坦對糖尿病大鼠血糖無明顯影響，但明顯降低腎重/體重及尿白蛋白水平（P0.05），減輕腎組織損傷。 4. DN組大鼠腎小球內12(S)-HETE水平較對照組明顯升高（P0.01），洛沙坦治療減少糖尿病大鼠腎小球內12(S)-HETE含量（P0.05）。 5.與對照組相比，DN組大鼠大腎小球內nephrin蛋白表達減少（P0.01），小腎小球內nephrin蛋白表達增加（P0.01），P-cadherin蛋白在大、小腎小球內表達均減少（P0.01）。洛沙坦增加糖尿病大鼠大腎小球內nephrin及大小腎小球內P-cadherin蛋白表達（P0.05）。 6.與對照組相比，DN組大鼠腎小球內足細胞形態(tài)標志蛋白緊密連接蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）和podocin表達減少（P0.05），而間充質標志蛋白collagenⅠ、纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、成纖維細胞特異性蛋白-1（fibroblast specific protein-1，F(xiàn)SP-1）和desmin表達增加（P0.05）。洛沙坦治療后，糖尿病大鼠腎小球內足細胞形態(tài)標志蛋白表達增加（P0.05），而間充質標志蛋白表達減少（P0.05）。 7. LOKO+STZ組小鼠尿白蛋白水平較WT組和LOKO組明顯升高（P0.01），但與WT+STZ組相比無統(tǒng)計學差異。2型DN組大鼠尿白蛋白水平較對照組明顯增加（P0.01），CDC治療明顯降低2型糖尿病大鼠的尿白蛋白水平（P0.05）。 8.1型糖尿病模型成功后一個月內，LOKO+STZ組小鼠血糖水平低于WT+STZ組；2型糖尿病模型成功后再給予CDC治療，CDC對血糖水平影響不明顯。 9.與對照組相比，2型DN組大鼠空腹胰島素水平明顯升高（P0.01），胰島素敏感指數(shù)明顯下降（P0.01），CDC治療后，糖尿病大鼠空腹胰島素水平明顯下降（P0.05），胰島素敏感指數(shù)明顯升高（P0.05）。 結論： 1.2型DN時AngⅡ和12-LO在腎小球內的相互作用可促進足細胞EMT，減少裂孔蛋白nephrin和P-cadherin表達。 2. ARB可阻斷AngⅡ和12-LO在腎小球內的相互作用，進而阻止足細胞的EMT、增加裂孔蛋白nephrin和P-cadherin表達，延緩蛋白尿進展。 3.12-LO可通過IR參與2型DN蛋白尿的發(fā)生與發(fā)展。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2;R692.9

【參考文獻】

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本文編號：2445665