【摘要】：目的:腎癌,是全球十大惡性腫瘤之一,居泌尿系統(tǒng)第二大腫瘤疾病,該疾病的全球發(fā)病率和死亡率每年上升2%-3%。它主要來(lái)源于腎實(shí)質(zhì),以透明細(xì)胞癌最為常見(jiàn),其占所有腎癌類型的75-80%。早期腎癌無(wú)癥狀且不易被發(fā)現(xiàn),晚期腎癌患者可出現(xiàn)患者出現(xiàn)腰痛、血尿、腹部包塊等癥狀。在診斷為腎癌的所有患者中,20-30%患者已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,這些患者在行手術(shù)治療后仍有30%比例患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展。但是如果在疾病早期能夠發(fā)現(xiàn)腎癌并進(jìn)行干預(yù),患者的5年生存率可以達(dá)到90%。目前,已報(bào)道的幾種腎癌相關(guān)預(yù)測(cè)因子,由于其個(gè)體異質(zhì)性及測(cè)定敏感度等方面的原因并無(wú)法廣泛引用于臨床中,因此尋找腎癌治療的新靶標(biāo)及腫瘤預(yù)測(cè)因子,成為近年來(lái)的主要研究熱點(diǎn)。組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase,HAT)是乙�；匾墓δ艿鞍酌�,它能把乙酰輔酶A的乙�；D(zhuǎn)移到組蛋白N端特定的賴氨酸殘基上,又被稱為賴氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶(lysine acetyltransferase,Kat)。Kat7(lysine acetyltransferase 7,Kat7)作為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的一個(gè)亞基,參與細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜的生物學(xué)功能,包括基因轉(zhuǎn)錄、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡等。作為HATs家族的一份子,Kat7是多種蛋白復(fù)合物的催化亞基,其中包括腫瘤抑制蛋白Ing4/5、JADE-1蛋白等,并能乙�；M蛋白H4,也能作為Cdt1的共激活子參與復(fù)制起始調(diào)節(jié);尤其是Kat7在DNA復(fù)制起始中可能作為復(fù)制因子Cdt1的共刺激因子起作用,Kat7也對(duì)細(xì)胞復(fù)制周期中的S期起重要作用。Kat7在多種原發(fā)癌中表達(dá)增加,包括乳腺癌、睪丸癌、卵巢癌及前列腺癌等。但是Kat7在腎癌中的尚未有明確報(bào)道,且對(duì)其腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的分子機(jī)制尚缺乏一定的認(rèn)識(shí)。內(nèi)容:首先,我們對(duì)腎癌患者病理標(biāo)本進(jìn)行Kat7檢測(cè),分析并統(tǒng)計(jì)其臨床意義;其次,通過(guò)對(duì)Kat7進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究,探究Kat7對(duì)腎癌生長(zhǎng)的影響;最后,通過(guò)研究Kat7與細(xì)胞周期蛋白cyclin B1的關(guān)系,尋找該分子調(diào)控腎癌生長(zhǎng)的部分機(jī)制。方法:首先,通過(guò)免疫組化及預(yù)后生存曲線分析Kat7與腎癌患者預(yù)后關(guān)系;其次,分別利用生長(zhǎng)曲線、克隆形成實(shí)驗(yàn)及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn),研究Kat7對(duì)腎癌生長(zhǎng)的影響;最后,采用RT-PCR、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)、蛋白酶體抑制等實(shí)驗(yàn),研究Kat7對(duì)cyclin B1之間的調(diào)控作用。結(jié)果:首先,我們利用免疫組化對(duì)本單位收集的55名腎癌患者病理標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)比較癌組織和癌旁組織間Kat7表達(dá)差異,結(jié)果表明腎癌與癌旁正常組織中Kat7的表達(dá)量存在差異,且腎癌組織中Kat7的表達(dá)量高于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;通過(guò)Kaplan-Meier生存曲線分析可知Kat7表達(dá)越高的腎癌患者無(wú)疾病生存期及總生存期越短。其次,在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中通過(guò)轉(zhuǎn)染慢病毒包裝質(zhì)粒p CDH-Kat7構(gòu)建的穩(wěn)定786-O腎癌細(xì)胞克隆,與其對(duì)照組腎癌細(xì)胞比較,CCK8結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)染p CDH-Kat7質(zhì)粒的786-O細(xì)胞組增殖能力上升,克隆形成實(shí)驗(yàn)說(shuō)明轉(zhuǎn)染p CDH-Kat7質(zhì)粒的786-O腎癌細(xì)胞集落數(shù)較對(duì)照組明顯增多;而且通過(guò)比較敲除Kat7的Caki-1細(xì)胞與其裸細(xì)胞,生長(zhǎng)曲線提示敲除Kat7的腎癌細(xì)胞Caki-1生長(zhǎng)受到抑制。為進(jìn)一步分析Kat7與腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)之間的關(guān)系,我們分別利用慢病毒過(guò)表達(dá)Kat7的786-O穩(wěn)定克隆及敲除Kat7腎癌細(xì)胞Caki-1與它們各自的對(duì)照細(xì)胞比較,通過(guò)流式細(xì)胞儀分析說(shuō)明了Kat7的表達(dá)能夠促進(jìn)腎癌細(xì)胞由G2期到M期的轉(zhuǎn)換,從而促進(jìn)腎癌細(xì)胞的增殖,蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)提示Kat7的過(guò)表達(dá)促進(jìn)cyclin B1蛋白的表達(dá);反之,Kat7敲除能夠抑制Caki-1細(xì)胞由G2期過(guò)渡到M期,最終阻滯了Caki-1細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。為深入研究Kat7與cyclin B1在細(xì)胞內(nèi)的相互作用,我們用Myc空載體質(zhì)粒及Myc-Kat7質(zhì)粒分別與Flag-cyclin B1共同轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞,收集細(xì)胞裂解物分別與Myc-beads偶聯(lián),進(jìn)行免疫共沉淀行Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Myc-Kat7蛋白能被G2/M期的cyclin B1特異性富集。為進(jìn)一步探索了Kat7與cyclin B1蛋白之間的直接相互作用,我們通過(guò)純化GST-cyclin B1融合蛋白,與轉(zhuǎn)染Myc-Kat7的786-O及Caki-1細(xì)胞裂解產(chǎn)物孵育,通過(guò)GST pull-down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Kat7蛋白與cyclin B1在體外具有直接且特異的相互作用。接下來(lái)為明確Kat7基因調(diào)控cyclin B1的具體機(jī)制,我們通過(guò)RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證Kat7對(duì)cyclin B1的調(diào)控,收取Kat7過(guò)表達(dá)樣品,將其一分為二,其中一份樣品通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Kat7的蛋白表達(dá),另外一份樣品通過(guò)提取RNA,并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成c DNA,最后通過(guò)RT-PCR儀檢測(cè)過(guò)表達(dá)Kat7及其與對(duì)照組cyclin B1的m RNA含量,與對(duì)照組比較,高表達(dá)Kat7組中cyclin B1的m RNA水平保持一致,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;同理,敲低Kat7的Caki-1腎癌細(xì)胞樣品中的m RNA水平與對(duì)照組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。為進(jìn)一步驗(yàn)證Kat7蛋白對(duì)cyclin B1的蛋白具有降解作用,通過(guò)比較正常對(duì)照細(xì)胞與敲低Kat7的786-O及敲除Kat7的Caki-1腎癌細(xì)胞中cyclin B1蛋白的表達(dá),收取細(xì)胞裂解產(chǎn)物,加入蛋白合成抑制劑的放線菌酮實(shí)驗(yàn),在不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞裂解產(chǎn)物,Western blotting檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明敲低Kat7的786-O細(xì)胞周期蛋白cyclin B1的半衰期縮短。為研究Kat7參與cyclin B1蛋白降解的作用方式,分別收取Kat7敲低的786-O及敲除Kat7的Caki-1的細(xì)胞裂解物,其中一組樣品在收取細(xì)胞裂解產(chǎn)物之前加入蛋白酶抑制劑MG132作用后,通過(guò)Western blotting檢測(cè)cyclin B1蛋白,結(jié)果說(shuō)明蛋白酶抑制劑能夠抑制Kat7對(duì)cyclin B1蛋白的降解。為驗(yàn)證Kat7的體內(nèi)對(duì)腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,通過(guò)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除Kat7的Caki-1細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)的腫瘤形成能力明顯弱于對(duì)照組動(dòng)物腎癌腫瘤模型動(dòng)物。結(jié)論:Kat7在腎癌中的表達(dá)高于癌旁,且與預(yù)后呈負(fù)相關(guān);Kat7能夠通過(guò)泛素蛋白酶體途徑調(diào)控cyclin B1周期蛋白,進(jìn)而調(diào)控腎癌生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明Kat7在腎癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用,該基因很可能成為新的預(yù)預(yù)測(cè)因子及治療靶點(diǎn),通過(guò)針對(duì)該靶點(diǎn)藥物的研發(fā),抑制該基因的表達(dá),從而抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng),這將為將來(lái)腎癌的治療提供新的治療策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.11
，

本文編號(hào)：2438311