發(fā)布時間：2019-02-13 01:02

【摘要】：研究目的:常染色體顯性多囊腎病是最常見的單基因遺傳性腎病,由PKD1或PKD2基因突變引起編碼的PC1和PC2表達異常所致,二種蛋白均表達于腎小管上皮細胞的初級纖毛。初級纖毛致病假說是目前最為關注的多囊腎病共同發(fā)病通路。前期課題組成功建立了多囊腎病PKD1基因敲入小鼠模型,通過蛋白組學的研究獲得了多個囊腫相關差異表達蛋白,其中蛋白cordon bleu(Cobl)經(jīng)過前期研究,發(fā)現(xiàn)在多囊腎病腎小管上皮細胞中表達異常,并引起初級纖毛的結構和功能變化。但Cobl如何被調控?Cobl又是通過哪個途徑來影響初級纖毛,其機制尚未明確。本課題擬通過Western-blot、Realtime PCR、免疫熒光等實驗方法,明確PC1/PC2的異常是否通過Ca2+/Ca M來調控Cobl表達;Cobl是否在SNX9作用下引起細胞骨架紊亂而導致初級纖毛異常。本課題的研究結果將豐富多囊腎病中初級纖毛的發(fā)病機制,為尋找干預靶標奠定一定的理論基礎。實驗方法:1.Ca M調控Cobl的機制研究:(1)通過免疫熒光、免疫組化方法觀察多囊腎細胞及小鼠腎臟組織中Ca M的定位變化情況。(2)應用Real-time PCR及Western blot方法檢測正常人腎小管上皮細胞(RCTEC)與不表達PC1的人多囊腎囊腫襯里上皮細胞(WT9-12),以及正常對照小鼠(pkd1+/+)與多囊腎病動物模型pkd1條件敲除小鼠(pkd1-/-)腎臟組織中Ca M的表達。(3)應用Western blot方法檢測RCTEC中經(jīng)si RNA干擾PC2表達對PC2、Ca M以及KIF3A的表達影響。(4)利用免疫共沉淀及免疫熒光方法檢測Ca M與Cobl之間存在的相互結合作用,以及應用免疫熒光的方法驗證RCTEC中Ca M與Cobl之間的定位。(5)應用Western blot方法檢測經(jīng)W7抑制RCTEC中Ca M表達后對Ca M、Cobl、KIF3A、IFT88的表達變化。(6)利用激光共聚焦顯微鏡觀察W7抑制Ca M的RCTEC中初級纖毛形態(tài)結構變化。(7)應用Western blot檢測經(jīng)Ca Cl2刺激RCTEC后Ca M、Cobl、KIF3A的表達變化。(8)利用激光共聚焦顯微鏡觀察經(jīng)Ca Cl2刺激RCTEC后初級纖毛形態(tài)結構變化。2.SNX9在Cobl影響初級纖毛結構和功能的作用研究:(1)通過免疫熒光、免疫組化方法觀察多囊腎細胞及小鼠腎臟組織中SNX9的定位變化。(2)應用Real-time PCR及Western blot方法檢測正常人腎小管上皮細胞(RCTEC)與人多囊腎囊腫襯里上皮細胞(WT9-12),以及正常對照小鼠(pkd1+/+)與多囊腎病動物模型pkd1條件敲除小鼠(pkd1-/-)腎臟組織中SNX9的表達。(3)應用Western blot方法檢測RCTEC中轉染Cobl質粒過表達和經(jīng)si RNA干擾Cobl后對Cobl、SNX9、KIF3A和IFT88的表達變化。(4)應用Real-time PCR檢測SNX9基因過表達慢病毒的滴度,應用Real-time PCR及Western blot方法進行病毒液目的基因表達檢測。(5)通過Western blot方法檢測RCTEC中SNX9基因慢病毒過表達對SNX9以及纖毛功能指標KIF3A和IFT88的表達變化。(6)應用Western blot檢測RCTEC中經(jīng)si RNA-SNX9干擾下調后SNX9和IFT88的表達。(7)利用激光共聚焦顯微鏡觀察SNX9基因慢病毒過表達SNX9及si RNA感染下調SNX9的RCTEC中F-actin、初級纖毛形態(tài)結構的變化。結果:1.Ca M調控Cobl的機制研究:(1)通過免疫熒光方法觀察發(fā)現(xiàn)Ca M主要定位于胞漿與核膜;免疫組化方法觀察發(fā)現(xiàn)pkd1+/+與pkd1-/-腎臟組織中Ca M主要位于腎小管中。(2)應用Real-time PCR及Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC中Ca M表達較WT9-12明顯增多;pkd1條件敲除小鼠(pkd1-/-)腎臟組織中也得到相同結果。(3)應用Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC經(jīng)si RNA干擾下調PC2表達后中PC2、Ca M、KIF3A表達均減少。(4)應用免疫共沉淀方法檢測發(fā)現(xiàn)Ca M與Cobl存在相互作用;同時,通過免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)RCTEC中Ca M與Cobl之間存在共定位。(5)應用Western blot及Real-time PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)W7抑制RCTEC中Ca M表達后,Ca M、Cobl、KIF3A和IFT88的表達均下降。(6)利用激光共聚焦顯微鏡觀察RCTEC中W7抑制Ca M后初級纖毛長度變短。(7)應用Western blot及Real-time PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)Ca Cl2刺激RCTEC后Ca M、Cobl、KIF3A的表達均增加。(8)利用激光共聚焦顯微鏡觀察經(jīng)Ca Cl2刺激RCTEC后初級纖毛長度變長。2.SNX9在Cobl影響初級纖毛結構和功能的作用研究:(1)應用免疫熒光、免疫組化方法觀察發(fā)現(xiàn)SNX9位于胞漿和細胞核,且主要位于腎小管。(2)應用Real-time PCR及Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC中SNX9表達較WT9-12中明顯增多;多囊腎病動物模型pkd1條件敲除小鼠腎臟組織中也有相同的結果。(3)應用Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC中轉染質粒過表達Cobl后,Cobl、SNX9、纖毛功能指標(KIF3A、IFT88)的表達均增加。(4)應用Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC中經(jīng)si RNA-Cobl轉染干擾Cobl表達后,Cobl、SNX9、KIF3A、IFT88的表達均減少。(5)SNX9基因過表達慢病毒大量包裝及應用Real-time PCR進行滴度測定,包裝所得慢病毒滴度至少為108 TU/ml;應用Real-time PCR及Western blot方法進行病毒液目的基因表達檢測,發(fā)現(xiàn)SNX9過表達慢病毒有過表達效果,且在MOI-5時感染率已達到飽和。(6)應用Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC中SNX9基因慢病毒過表達SNX9后,SNX9、KIF3A和IFT88的表達均增加。(7)應用Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC中SNX9-si RNA下調SNX9表達后,SNX9、KIF3A、IFT88的表達均減少。(8)利用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)RCTEC中SNX9基因慢病毒過表達SNX9,F-actin聚合增加,纖毛長度增加;而si RNA感染下調SNX9的RCTEC中F-actin含量減少,初級纖毛長度變短。結論:根據(jù)本研究的結果,表明當多囊腎基因PKD1、PKD2突變引起PC1、PC2表達異常后,Ca2+內流減少,Ca M表達降低,Cobl表達也隨之減少。而Cobl異常通過SNX9影響F-actin的聚合作用,最終導致初級纖毛長度變短、細胞內鈣離子濃度減少,進一步導致Ca M表達減少,產(chǎn)生惡性循環(huán),加重多囊腎病的發(fā)生發(fā)展。而上調Cobl的上游Ca M或者下游SNX9表達能改善F-actin聚合作用,使初級纖毛長度增加。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R692

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 梅長林;多囊腎病實驗與臨床研究進展[J];中華內科雜志;2002年08期

2 房愛蓮,尹仲魯;家族性多囊腎病五例[J];中華醫(yī)學遺傳學雜志;2003年05期

3 戴兵;劉亞偉;梅長林;;多囊腎病實驗及治療進展[J];中華腎臟病雜志;2006年11期

4 原愛紅,梅長林;多囊腎病凋亡研究進展[J];國外醫(yī)學.泌尿系統(tǒng)分冊;2001年01期

5 馮敏,薛素霞;多囊腎病多器官損害9例臨床觀察[J];河南職工醫(yī)學院學報;2001年04期

6 張樹忠,梅長林,戴兵,孫田美,趙海丹,張殿勇,湯兵,周玉琨,李林,沈學飛,吳玉梅,宋吉;漢族人多囊腎病1型致病基因突變檢測體系的建立及初步應用[J];中華檢驗醫(yī)學雜志;2002年04期

7 韓紅彥,楊琳,王旭,王晗瑩,陳壽松,肖同諾,王青,羅玲;多囊腎病178例的遺傳家系調查[J];第二軍醫(yī)大學學報;2003年01期

8 張鑫,鄭敬民;多囊腎病分子基礎研究進展[J];腎臟病與透析腎移植雜志;2004年03期

9 彭鳳娣,姬可平;先天性多囊腎病的基因分析[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2004年06期

10 梅長林,王文靖;多囊腎病的診斷及治療進展[J];中國實用內科雜志;2005年11期

相關會議論文 前8條

1 肖靜;高建東;何立群;;多囊腎病的研究現(xiàn)狀及進展[A];第十九次全國中醫(yī)腎病學術交流會論文匯編[C];2006年

2 李林;沈甫明;戴兵;梅長林;Vincent TE;;酪氨酸激酶抑制劑治療多囊腎病大鼠的實驗研究[A];“中華醫(yī)學會腎臟病學分會2004年年會”暨“第二屆全國中青年腎臟病學術會議”論文匯編[C];2004年

3 熊錫山;謝君怡;付莉莉;丁濤;戴兵;梅長林;;羥甲戊二酰輔酶A還原酶抑制劑治療多囊腎病實驗研究[A];中華醫(yī)學會腎臟病學分會2006年學術年會論文集[C];2006年

4 李林;周玉坤;華振浩;梅長林;;表皮生長因子及其受體在人類多囊腎病發(fā)病中的作用[A];2007年浙滬兩地腎臟病學術年會資料匯編[C];2007年

5 馮薇;王東光;逯力;;成年型多囊腎病的超聲診斷與分析[A];中華醫(yī)學會第六次全國超聲醫(yī)學學術年會論文匯編[C];2001年

6 戴兵;劉亞偉;熊錫山;丁濤;鄒祝英;梅長林;;羅格列酮治療多囊腎病基因敲除動物模型pkd2~(WS25/-)小鼠的實驗研究[A];2007年浙滬兩地腎臟病學術年會資料匯編[C];2007年

7 劉潔瓊;梅長林;熊錫山;戴兵;付莉莉;賈潔爽;;多囊腎病EGFR酪氨酸激酶對PPAR γ信號通路的影響[A];2007年浙滬兩地腎臟病學術年會資料匯編[C];2007年

8 熊錫山;付莉莉;戴兵;沈建華;蔣華良;梅長林;;新型PPAR-γ激動劑DC041336治療多囊腎病實驗研究[A];2007年浙滬兩地腎臟病學術年會資料匯編[C];2007年

相關重要報紙文章 前6條

1 王雪飛 吳基友 戎殳;阻擋多囊腎病人滑向腎衰[N];健康報;2005年

2 嚴志明；仇逸;我國多囊腎病防治研究獲突破[N];中國醫(yī)藥報;2004年

3 本報記者 陳青;多囊腎治療難題有望破解[N];文匯報;2008年

4 嚴志明;我國多囊腎病防治獲突破[N];大眾衛(wèi)生報;2004年

5 董利波;雙腎長滿囊腫 鏡下“各個擊破”[N];健康報;2003年

6 張強　王曉輝 張波;用心呵護“生命之源”[N];科技日報;2010年

相關博士學位論文 前4條

1 楊明;新型mTOR抑制劑Y31延緩大鼠多囊腎病進展的作用及機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2016年

2 戚娜;EZH2及其介導的STAT3甲基化在常染色體顯性多囊腎病中的作用研究[D];第二軍醫(yī)大學;2017年

3 李林;表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑治療多囊腎病的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學;2004年

4 徐成鋼;中藥三棱及土鱉蟲對多囊腎病襯里上皮細胞增殖和信號轉導作用的研究[D];第二軍醫(yī)大學;2001年

相關碩士學位論文 前3條

1 陳歡歡;200例成人型多囊腎病患者臨床特征分析及中醫(yī)證候研究[D];廣州中醫(yī)藥大學;2016年

2 申嬡文;多囊腎病中Cordon-bleu影響初級纖毛結構和功能的上下游機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2017年

3 姜蓓蓓;散結消積法干預多囊腎病的臨床研究[D];山東中醫(yī)藥大學;2013年

，

本文編號：2420997