發(fā)布時(shí)間：2019-02-11 09:35

【摘要】：目的:臨床發(fā)現(xiàn)慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)患者血管鈣化發(fā)生率是普通人群的10~30倍。有研究發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境能夠抑制腎衰竭大鼠血管及軟組織鈣化,但其中的機(jī)制目前尚不清楚�；罨疶細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T-cells,NFAT)最初是在T細(xì)胞中因其免疫調(diào)節(jié)功能被發(fā)現(xiàn)的,之后的研究表明NFAT在成骨細(xì)胞分化和某些刺激誘導(dǎo)的血管鈣化中也發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)擬觀察NFATc1在酸抑制血管鈣化過程中發(fā)揮的作用及其可能機(jī)制。方法:1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.1動(dòng)物模型制備將24只清潔級(jí)5周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組、慢性腎衰竭組、血管鈣化組、酸干預(yù)鈣化組。其中假手術(shù)組大鼠進(jìn)行腎周筋膜分離,使用1.5%甲基纖維素進(jìn)行每日灌胃;慢性腎衰竭組進(jìn)行5/6腎切除術(shù),使用1.5%甲基纖維素進(jìn)行每日灌胃;血管鈣化組進(jìn)行5/6腎切除術(shù),使用1.5%甲基纖維素+骨化三醇(600 ng-1·kg-1·24 h-1)進(jìn)行每日灌胃;灌胃,酸干預(yù)組大鼠行5/6腎切除術(shù),使用1.5%甲基纖維素+骨化三醇(同上)+0.28mmol/L氯化銨每日飼喂。慢性腎衰竭組、血管鈣化組大鼠分別死亡1只,其余兩組大鼠均存活,飼養(yǎng)36天后處死全部大鼠,取目的組織。1.2模型制備判斷方法大鼠飼養(yǎng)5周(適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,模型制備+術(shù)后恢復(fù)共1周,給予刺激3周,共計(jì)5周)后,采血檢測(cè)血肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)水平,同時(shí)取動(dòng)脈血測(cè)p H值、HCO3-濃度。1.3對(duì)大鼠主動(dòng)脈的檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈Runx2及NFATc1的表達(dá)水平;采用von Kossa鈣化染色法觀察血管鈣化情況;用鈣含量測(cè)定試劑盒(鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法)按說明書方法測(cè)定主動(dòng)脈鈣含量。2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)2.1細(xì)胞分組將VSMCs隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組、高磷+p H7.4組、高磷+p H7.1組。使用鹽酸和碳酸氫鈉調(diào)整培養(yǎng)基p H值,每24小時(shí)換液一次。2.2采用茜素紅染色方法判斷VSMCs鈣鹽沉積情況;測(cè)定細(xì)胞鈣含量。2.3 Western印跡法檢測(cè)VSMCs目的蛋白的表達(dá):干預(yù)4 d后提取細(xì)胞蛋白,測(cè)定NFATc1和Runx2蛋白的表達(dá)。細(xì)胞蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離以及轉(zhuǎn)膜、封閉后,先后加一抗稀釋液(NFATc1 1:1000,Runx2 1:500,GAPDH 1:5000)、二抗稀釋液(1:5000),后顯影、分析條帶灰度值。3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,若是符合正態(tài)分布的計(jì)量資料,則采用(?)±s表示,若是兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較,則采用t檢驗(yàn)分析,多個(gè)樣本均數(shù)比較用單因素方差分析,組間兩兩比較用S-N-K檢驗(yàn)。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1酸對(duì)慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的影響:von Kossa染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組、慢性腎衰竭組未見鈣化發(fā)生,血管鈣化組大鼠主動(dòng)脈發(fā)生明顯鈣化,酸干預(yù)鈣化組大鼠主動(dòng)脈鈣化明顯比血管鈣化組減少。鈣含量測(cè)定結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,慢性腎衰竭組大鼠主動(dòng)脈鈣含量無明顯增高(P0.05),鈣化組大鼠主動(dòng)脈鈣含量顯著增高(P0.05);與鈣化組相比,酸干預(yù)組大鼠主動(dòng)脈鈣含量明顯降低(P0.05)。2酸對(duì)慢性腎衰竭大鼠Runx2表達(dá)的影響:Runx2免疫組織化學(xué)評(píng)分的結(jié)果顯示,血管鈣化組大鼠的Runx2的免疫組化評(píng)分比假手術(shù)組和慢性腎衰竭組升高;酸干預(yù)組Runx2評(píng)分低于血管鈣化組。3酸對(duì)慢性腎衰竭大鼠NFATc1表達(dá)的影響:血管鈣化組大鼠的NFATc1的免疫組化評(píng)分比假手術(shù)組和慢性腎衰竭組升高;酸干預(yù)組NFATc1評(píng)分低于血管鈣化組。4鈣化血管NFATc1表達(dá)與Runx2表達(dá)的相關(guān)性:相關(guān)分析顯示,發(fā)生鈣化的大鼠血管中NFATc1表達(dá)與Runx2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.877,P=0.000)。5酸性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs鈣化的影響:細(xì)胞培養(yǎng)14d后,與正常對(duì)照組相比,高磷+p H7.4組可見大量橘紅色鈣鹽沉積;與高磷+p H7.4組相比,高磷+p H7.1組細(xì)胞鈣鹽沉積減輕。鈣含量結(jié)果與鈣化染色相似,與正常對(duì)照組相比,高磷+p H7.4組鈣含量明顯增多(P0.05);與高磷+p H7.4組相比,高磷+p H7.1組細(xì)胞鈣含量明顯減少(P0.05)。6酸性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的大鼠VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響:Western印跡結(jié)果顯示,同正常對(duì)照組相比,高磷+p H7.4組Runx2蛋白表達(dá)水平增加(P0.05);與高磷+p H7.4組相比,高磷+p H7.1組Runx2表達(dá)量明顯減少(P0.05)。ALP活性測(cè)定結(jié)果顯示,高磷+p H7.1組ALP活性明顯低于高磷+p H7.4組(P0.05)。7酸性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的VSMCs NFATc1蛋白表達(dá)的影響及其與Runx2和ALP活性的相關(guān)性:正常對(duì)照組與高磷+p H7.4組NFATc1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,高磷環(huán)境NFATc1表達(dá)升高;高磷+p H7.4組與高磷+p H7.1組NFATc1表達(dá)水平相比,高磷+p H7.1組NFATc1表達(dá)低于高磷+p H7.4組。相關(guān)分析顯示,VSMCs中NFATc1表達(dá)與Runx2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.801,P=0.003),NFATc1表達(dá)與ALP活性亦呈正相關(guān)(r=0.698,P=0.002)。結(jié)論:酸抑制血管鈣化的可能機(jī)制是通過下調(diào)NFATc1表達(dá)繼而抑制血管鈣化發(fā)生而發(fā)揮作用的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R692.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Sinee Disthabanchong;;Vascular calcification in chronic kidney disease: Pathogenesis and clinical implication[J];World Journal of Nephrology;2012年02期

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本文編號(hào)：2419607