【摘要】：【研究背景】： 膀胱癌是現(xiàn)階段全世界泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一(1)，是一種直接威脅患者生存的疾病。Prakin M報(bào)道了世界范圍內(nèi)膀胱癌的發(fā)病率居常見腫瘤的第9位，病死率居第13位(2)。近年來，隨便工業(yè)污染的愈發(fā)嚴(yán)重以及診療手段的提高，膀胱癌的發(fā)病率以及診出率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。有學(xué)者統(tǒng)計(jì)分析得出，從1985年到2005年，膀胱癌的新確診人數(shù)增加了將近50%(3)，已經(jīng)成為了研究影響人們生活健康狀況的常見惡性腫瘤之一。目前，對(duì)膀胱癌的診斷、治療等諸多方面尚且缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，使得對(duì)其的診療仍然存在進(jìn)步的空間。膀胱癌中有80%左右的膀胱癌為淺表型腫瘤，目前的主要方式是經(jīng)尿道電切（TURBt）；已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，TURBt治療膀胱癌術(shù)后會(huì)有10%-65%的患者在1年內(nèi)復(fù)發(fā)；超過24%-84%的患者在5年內(nèi)復(fù)發(fā)；有將近20%的患者復(fù)發(fā)后，腫瘤的惡性程度會(huì)增加；10%的患者最終會(huì)發(fā)展為侵潤性癌或者轉(zhuǎn)移；同樣，有些分化良好的腫瘤會(huì)在5年內(nèi)發(fā)生進(jìn)展為侵潤型腫瘤，并發(fā)生轉(zhuǎn)移(3)。侵潤型膀胱癌的治療方式以手術(shù)切除為主(4)，但創(chuàng)傷大、并發(fā)癥多、5年生存率低（54.5%-68%）是手術(shù)治療的缺點(diǎn)(3.4)，且易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移。這一系列的原因使得膀胱癌的診療仍然是目前泌尿系腫瘤的難點(diǎn)。到目前為止，仍沒有發(fā)現(xiàn)膀胱癌有關(guān)的特異性生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)，且形成機(jī)制尚未完全闡明，這使得膀胱癌的治療更加困難。所以，進(jìn)一步的研究膀胱癌的發(fā)病分子機(jī)制，具有十分重要的科學(xué)意義。 膀胱癌的形成受到多種不同作用因素的共同作用：包括：①相關(guān)基因發(fā)生突變；②致癌基因的表達(dá)增加或者過表達(dá)；③全身因素；④腫瘤與周圍基質(zhì)間的各自作用；⑤尿路上皮細(xì)胞所處微環(huán)境的改變；⑥外界致癌物質(zhì)的刺激(5)；在致癌物質(zhì)的刺激或者抑癌基因表達(dá)下降的情況下，正常膀胱細(xì)胞DNA產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致了膀胱腫瘤的生成和發(fā)展。在這個(gè)過程中，致癌基因的激活以及抑癌基因的失活，起到重要作用(6)。目前，研究的熱點(diǎn)主要集中在膀胱癌發(fā)生進(jìn)展中抑癌基因的作用上。抑癌基因的突變、失活、丟失，都會(huì)導(dǎo)致膀胱癌。因此，導(dǎo)入野生型抑癌基因以修補(bǔ)缺陷，使得腫瘤抑癌基因的功能得以恢復(fù)，是膀胱癌的治療方法之一(7)。抑癌基因是細(xì)胞分化增殖過程中發(fā)揮重要作用的調(diào)節(jié)因子之一，在正常細(xì)胞中發(fā)揮了阻滯細(xì)胞異常增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化的功能。抑癌基因如果發(fā)生突變或者失活，可以趨向細(xì)胞的異常分裂增殖，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生（8.9.10）。 MicroRNAs（miRNA）亦稱微小RNA，是一種約由21-23個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼小分子RNA。細(xì)胞內(nèi)的miRNA是獨(dú)立的編碼基因，是機(jī)體遺傳信息的重要組成部分(11)。MiRNA由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄成為miRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄體，隨后被酶在核內(nèi)即切割形成miRNA前體，而后被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞胞漿中加工形成成熟的miRNA以堿基互補(bǔ)的形式與同源mRNA互補(bǔ)配對(duì)，從而誘導(dǎo)miRNA的切割降解、翻譯或者其他形式調(diào)控抑癌基因的表達(dá)，這就是轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)的調(diào)控過程(12)。目前，研究發(fā)現(xiàn)它主要通過與靶基因的miRNA3’-UTR區(qū)域（mRNA的3’的非翻譯區(qū)）相互補(bǔ)充配對(duì)，從而發(fā)揮沉默或者激活特定靶基因的作用(13)。越來越多的研究證據(jù)表明，miRNAs是普遍廣泛存在于各種動(dòng)植物以及病毒中，在人類等哺乳類動(dòng)物中有超過30%的基因是受到miRNAs調(diào)控的。研究結(jié)果顯示，miRNA在生物體的發(fā)育、增殖、分化或者凋亡中，特別是腫瘤的發(fā)生發(fā)展等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。隨著研究的不斷深入，越來越多的miRNAs被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道(14)。有很多學(xué)者認(rèn)為，miRNAs的改變?cè)谌祟惖哪[瘤的病理生理發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵性作用，甚至有人提出miRNAs的異常是最重要的腫瘤發(fā)生發(fā)展的原因。通過對(duì)已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行回顧，我們發(fā)現(xiàn)miRNAs的異常表達(dá)存在于許多腫瘤中，包括：泌尿系腫瘤、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤以及白血病(15)。MiRNAs通過調(diào)控下游靶基因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了至關(guān)重要的致癌或抑癌基因的功能(16)。 在我們的前期研究中，通過MicroRNA芯片技術(shù)檢測(cè)了膀胱癌組織以及癌旁組織中miRNA的異常表達(dá)，發(fā)生在膀胱癌組織中，miR-152的表達(dá)是明顯降低的，進(jìn)一步通過Real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證實(shí)：與正常組織相比，miR-152是膀胱癌細(xì)胞中下調(diào)最明顯的miRNA之一，所以我們推斷：miR-152可能在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起到了抑癌基因的作用。然而，miR-152在膀胱癌中的具體功能尚無研究報(bào)道，因此，有必要對(duì)miR-152在膀胱癌中的作用機(jī)制進(jìn)行研究。 【目的】: 1．研究miR-152在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中的作用，確定miR-152是膀胱癌發(fā)生進(jìn)程中是否起到了重要的抑癌基因作用，是否由于miR-152的缺失導(dǎo)致了膀胱癌的發(fā)生以及發(fā)展。 2．確定miR-152的下調(diào)，是否導(dǎo)致了DNA甲基化的程度上調(diào)。是否DNA甲基化程度下降后，miR-152的表達(dá)是否會(huì)升高。 3．鑒定miR-152調(diào)控的下游靶基因，分析并提出由于miR-152缺失導(dǎo)致的膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的作用途徑。 【材料和方法】: 1.培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞和人類膀胱上皮永生化細(xì)胞，檢測(cè)miR-152的表達(dá)情況。 通過Real-time檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞株T24和人類膀胱上皮永生化細(xì)胞Sv-huc-1中miR-152的表達(dá)情況。 2.觀察miR-152對(duì)膀胱癌細(xì)胞和人類膀胱上皮永生化細(xì)胞的生物學(xué)行為影響。 轉(zhuǎn)染miR-152mimics到T24細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-152inhibitor到Sv-huc-1中，分別通過細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞集落形成和Real-time PCR檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞株的細(xì)胞增殖能力。 3.鑒定miR-152調(diào)控的下游靶基因。 靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScans預(yù)測(cè)miR-152在膀胱癌中的潛在靶基因是DNMT1。分別構(gòu)建含有DNMT1基因的3’端非編碼區(qū)域序列DNMT13’-UTR（DNMT1-WT）和突變序列DNMT13’-UT（RDNMT1-MU）的熒光素酶報(bào)道，檢測(cè)miR-152的作用區(qū)域。轉(zhuǎn)染miR-152后，采用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)miR-152和潛在靶基因DNMT1蛋白的表達(dá)裱花，進(jìn)一步通過Real-time PCR檢測(cè)靶基因DNMT1下游基因的表達(dá)變化，進(jìn)而闡明miR-152以及其靶基因在膀胱癌中的可能的作用機(jī)理。 【結(jié)果】: 1. Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果表明，在人類膀胱上皮永生化細(xì)胞Sv-huc-1中miR-152是高表達(dá)的；同時(shí)，DNA甲基化程度很低。而在膀胱癌細(xì)胞株T24中，miR-152是低表達(dá)的，同時(shí)DNA甲基化程度很高（P0.01）。 2.細(xì)胞計(jì)算實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-152是顯著抑制膀胱癌細(xì)胞株T24的增殖的（P0.01）。 3. TargetScans軟件預(yù)測(cè)DNMT1可能是miR-152的潛在靶基因，DNMT1基因3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)（3’-UTR）包含了miR-152的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果表明：在轉(zhuǎn)染miR-152和DNMT1-WT的熒光報(bào)告載體的熒光強(qiáng)度受到了顯著抑制（P0.001），而突變型DNMT1（DNMT1-MU）基因的熒光報(bào)告載體的熒光強(qiáng)度基本不受影響。 4.轉(zhuǎn)染miR-152模擬劑后，采用Western blot以及Real-time PCR檢測(cè)DNMT1的表達(dá)情況，以檢測(cè)DNA甲基化程度。我們發(fā)現(xiàn)DNMT1酶表達(dá)受到抑制。轉(zhuǎn)染miR-152后，，采用Real-time PCR檢測(cè)受DNA甲基化調(diào)控的下游基因。我們發(fā)現(xiàn)HoxA9的表達(dá)是下調(diào)的。以此我們推測(cè)，HoxA9是受DNA甲基化調(diào)控的下游靶基因。 【結(jié)論】: 1：MicroRNA-152在膀胱細(xì)胞中，是高表達(dá)；在膀胱癌細(xì)胞中是低表達(dá)的。在正常膀胱細(xì)胞中，DNA甲基化的程度很低。隨著癌變的發(fā)生，DNA甲基化的程度，有所增加。 2：MiR-152表達(dá)改變后，作用于DNA的3’-UTR區(qū)域，導(dǎo)致了DNA發(fā)生甲基化，或DNA甲基化程度增加。 3：在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程中，miR-152起到了抑癌基因的作用。 4：在膀胱癌中，HoxA9是受DNA甲基化調(diào)控的下游靶基因之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.14

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