【摘要】：研究背景及目的：目前,北美地區(qū)男性惡性腫瘤中,前列腺癌依舊是發(fā)病率最高的腫瘤,死亡率僅次于肺癌。盡管檢測血清PSA早期篩查臨床前列腺癌患者已得到更加廣泛的應(yīng)用,臨床治療前列腺癌有激素、手術(shù)、放射等有效治療方法,但是,仍有許多前列腺癌患者最終都由于前列腺的進展而死亡。臨床發(fā)現(xiàn),通過早期篩查發(fā)現(xiàn)的高惡性程度的病例在及時的根治性切除術(shù)治療,在短期內(nèi)可能也會出現(xiàn)生化復(fù)發(fā)或臨床轉(zhuǎn)移。因此,這種類型的病例一般認為除了需要早期的確診并且及時的根治性治療外,術(shù)后接受輔助性的化療或放療也很有必要。然而,大部分的前列腺癌病例進展緩慢,甚至終生不發(fā)病,在臨床上被認為是“惰性”的腫瘤。不少前列腺癌臨床患者在長期的隨訪檢查中出現(xiàn)PSA的升高,在這部分患者中大約有三分之一的患者在前列腺癌根治術(shù)術(shù)后幾年內(nèi)出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移。臨床上預(yù)測前列腺癌生化復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物主要有患者PSA水平、Gleason評分和影像學(xué)資料。但是,患者的臨床診斷和預(yù)后與長期的臨床篩查和隨訪檢查的結(jié)果有時確是相反的,根據(jù)現(xiàn)有的臨床預(yù)后標(biāo)記物比如血清PSA水平、Gleason評分和病理分期有時也很難預(yù)測患者的預(yù)后。因此,我們迫切需要尋找更好的臨床預(yù)后標(biāo)記物來篩出需要進一步干預(yù)治療的患者,并依此制定出更合適的治療方案。小分子RNA (microRNAs, miRNAs)在由大約22個核苷酸構(gòu)成,它們以堿基配對的方式與編碼蛋白的mRNA的3’端非編碼區(qū)(3’UTR)結(jié)合,引起靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄抑制和mRNA降解。miRNA在正常組織和細胞分化、增殖和凋亡中起重要調(diào)節(jié)功能。在不同的惡性腫瘤中已發(fā)現(xiàn)miRNA的表達有改變,并且miRNA被認為是調(diào)控腫瘤進展的關(guān)鍵因子。超過50%的miRNA位于易損的基因結(jié)構(gòu)域上,因此,miRNA在腫瘤細胞中容易擴增、缺失或變位。miRNA在腫瘤中的異常表達通常被認為是因為miRNA的生物合成出現(xiàn)異常、啟動子甲基化的改變和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控而引起miRNA基因合成受影響。部分miRNA被認為是促癌因子或抑癌因子,最新研究發(fā)現(xiàn)部分miRNA在前列腺癌中表達異常,并且影響前列腺癌的激素依賴性、增殖、遷移、侵襲、細胞周期和凋亡。眾多miRNAs中,對于miR-30d在腫瘤中作用的研究是近幾年miRNAs領(lǐng)域的熱點。miR-30d已被證實了在多種惡性腫瘤中表達上調(diào),并發(fā)揮關(guān)鍵的促癌作用,包括黑色素瘤、肺癌、肝細胞癌和周圍神經(jīng)鞘瘤。證實了miR-30d可通過直接調(diào)控靶標(biāo)基因的表達從而參與調(diào)控腫瘤細胞的生物學(xué)功能過程,例如細胞周期、細胞凋亡、細胞遷移、細胞侵襲和血管生長等,參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,并最終影響腫瘤的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后。一般認為,miRNAs的生物學(xué)功能具有高度的組織和細胞特異性,miR-30d也不例外。研究證明,在黑色素瘤組織和細胞中,miR-30d表達明顯上調(diào)并且可通過抑制靶標(biāo)基因半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶GALNT7的mRNA表達,增加免疫抑制因子IL-10的表達,降低機體的免疫細胞活性和聚集,促進腫瘤的侵襲力和免疫抑制,最終誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。目前,miR-30d在前列腺癌細胞和組織中的基因表達和對腫瘤的生物學(xué)功能尚未完全清楚。本研究旨在探索miR-30d在前列腺癌中的作用及其調(diào)控的靶基因。材料：1.人臨床組織來源：18對配對的原發(fā)性前列腺癌及癌旁良性前列腺冰凍組織從廣州市第一人民醫(yī)院組織庫獲得；Taylor I臨床前列腺癌組織芯片數(shù)據(jù)庫作為GEO的數(shù)據(jù)資源,其中前列腺癌組織miRNA表達譜芯片包含有詳細臨床隨訪數(shù)據(jù)的113個原發(fā)性前列腺癌病例；本研究所應(yīng)用的包含225例人原發(fā)性前列腺癌組織和25例癌旁良性前列腺組織的前列腺組織芯片(Tissue microarrays,TMA),是美國麻省總醫(yī)院(MGH)泌尿病理科所收集的1993年到1995年期間在接受前列腺癌根治術(shù)患者的前列腺組織。2.動物：20只年齡在4-5周的BALB/c雄性裸鼠購買于廣東醫(yī)學(xué)實驗動物中心。3.細胞株：良性的前列腺上皮細胞株P(guān)rEC是從美國的Lonza公司購買獲得。前列腺癌細胞株P(guān)C3、DU145和LNCaP都是于2012年從美國馬納薩斯州的美國菌種保藏中心(ATCC)公司購買。方法：1.通過利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定miR-30d過表達和抑制表達DU145和LNCaP細胞株；核酸或質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染DU145和LNCaP構(gòu)建靶基因MYPT1、 miR-30d和靶基因MYPT1同時過表達等細胞株。2.通過統(tǒng)計學(xué)方法分析Taylor臨床前列腺癌組織miRNA芯片數(shù)據(jù)庫中miR-30d的表達水平與前列腺癌患者的臨床特征以及預(yù)后的相關(guān)性。3.細胞功能實驗分析miR-30d在體外對前列腺癌細胞功能的影響,以及靶基因MYPT1能否拮抗miR-30d對前列腺癌細胞引起的效應(yīng),包括HUVEC細劃痕實驗、侵襲實驗、管腔生成實驗。裸鼠皮下接種DU145和LNCaP細胞株形成裸鼠皮下移植瘤模型,用于分析miR-30d在體內(nèi)對前列腺癌成瘤和轉(zhuǎn)移方面的影響。4.利用基因表達譜芯片技術(shù)對過表達miR-30d和NC對照的LNCaP和DU145細胞株進行基因表達譜分析,獲得一批miR-30d調(diào)控的差異表達基因。利用生物信息學(xué)軟件IPA和GO功能分析差異基因相關(guān)的信號通路、生物學(xué)功能和疾病。5.通過利用Target-Scan、miRWalk和miRanda等miRNAs靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miR-30d調(diào)控的潛在靶基因；熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-30d直接調(diào)控的靶基因。6. qRT-PCR檢測miR-30d過表達和空白對照的LNCaP細胞株中候選靶基因CALD1、TNPO1、ATP2B1、SEPT7、MYPT1、ZNF148、CEP350、KIF5B、 STAG2和GALNT1的表達水平。qRT-PCR分別檢測前列腺癌細胞株P(guān)C3、DU145和LNCaP,正常前列腺上皮細胞株P(guān)rEC,以及18對前列腺癌和對應(yīng)的癌旁良性前列腺組織的miR-30d的表達水平。通過統(tǒng)計學(xué)方法分析Taylor I臨床前列腺癌組織miRNA芯片數(shù)據(jù)庫中miR-30d與MYPT1的mRNA表達的相關(guān)性。7.蛋白質(zhì)印跡法檢測miR-30d異常表達的DU145和LNCaP細胞株以及裸鼠皮下移植瘤組織中靶基因MYPT1和VEGF的蛋白水平；蛋白質(zhì)印跡法檢測靶基因MYPT1表達異常的相關(guān)細胞株構(gòu)建是否成功；蛋白質(zhì)印跡法檢測miR-30d表達升高或MYPT1表達抑制的DU145和LNCaP細胞中MYPT1下游作用蛋白總cJUN、磷酸化cJUN (ser63)、磷酸化cJUN (ser73)和VEGF的蛋白表達水平。8.免疫組織化學(xué)分析MYPT1和免疫熒光分析CD31在前列腺臨床組織芯片中的表達情況；免疫組織化學(xué)分析miR-30d異常表達的DU145和LNCaP細胞株接種形成的裸鼠皮下腫瘤組織中CD31和MMP-9的表達情況。統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包處理。利用Pearson卡方檢驗分析計數(shù)資料。采用Kolmogorov-Smirnov (K-S)檢驗評估Taylor臨床前列腺癌組織芯片數(shù)據(jù)庫中miR-30d的基因表達水平分布的正態(tài)分布性。定量資料結(jié)果采用兩獨立樣本t檢驗分析(qRT-PCR、免疫組化、白質(zhì)印跡法和細胞功能實驗)。Taylor臨床前列腺癌組織芯片數(shù)據(jù)庫中的miR-30d基因表達水平和前列腺癌患者臨床特征之間的關(guān)系采用兩獨立樣本t檢驗和One-way ANOVA檢驗。比較不同時間點的兩組數(shù)據(jù)之間差異采用重復(fù)測量方差法。前列腺癌患者臨床生存分析采用Kaplan-Meier方法及l(fā)og-rank檢驗,評估m(xù)iR-30d、MYPT1和CD31以及MYPT1和CD31共表達能否成為前列腺癌預(yù)后的獨立預(yù)測指標(biāo)采用COX回歸模型單因素和多因素分析。臨床前列腺癌組織標(biāo)本中miR-30d和MYPT1基因表達量之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。連續(xù)變量以X±s的形式展示。P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：1.相對正常前列腺上皮細胞株P(guān)rEC, miR-30d在PC3、DU145和LNCaP細胞株中的表達量均顯著性上調(diào)(P0.001); miR-30d在人臨床前列腺癌組織中的表達量相對于癌旁良性前列腺組織的表達量同樣顯著性下調(diào)(P=0.040)。2.利用Taylor I臨床前列腺癌組織miRNA芯片數(shù)據(jù)庫分析顯示miR-30d的基因表達水平與患者術(shù)前PSA水平、Gleason評分、臨床分期和病理分期存在正相關(guān)關(guān)系(P值分別為0.003、0.01、0.007和0.004),miR-30d基因的上調(diào)表達與前列腺癌患者術(shù)后發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移和生化復(fù)發(fā)正相關(guān)(P=0.001,0.002),然而,miR-30d的表達水平與患者的年齡和是否死亡不存在顯著的相關(guān)性(P0.05)。Kaplan-Meier和Log rank方法顯示miR-30d高表達組患者術(shù)后的總體生化復(fù)發(fā)生存率和總體生存率顯著性增加(P0.001和P=0.041)。COX回歸單因素分析結(jié)果提示患者腫瘤病理分期[HR：5.32(2.36-11.99)]、Gleason評分[HR：10.765(4.896-23.669)]和miR-30d表達水平[HR：3.834(1.615-9.102)]可能為評估前列腺癌患者術(shù)后生化復(fù)發(fā)風(fēng)險的預(yù)測因子,而患者年齡、術(shù)前血清PSA水平、腫瘤臨床分期并不是評價前列腺癌預(yù)后的預(yù)測因子。利用COX回歸模型多因素分析,結(jié)果提示miR-30d基因表達水平[HR：3.510(1.387-8.878)]、Gleason評分[HR：7.433(2.941-18.784)]和病理分期[HR：3.175(1.172-8.600)]能夠作為預(yù)測前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)風(fēng)險的獨立指標(biāo)。3.體外細胞功能實驗顯示miR-30d過表達的DU145和LNCaP細胞株的增殖、遷移、侵襲和促進血管內(nèi)皮細胞微管生成能力相對空白對照組明顯增強(P0.05)。相反,miR-30d抑制表達的DU145和LNCaP細胞株的增殖、遷移、侵襲和促進血管內(nèi)皮細胞微管生成能力相對對照組明顯減弱(P0.05)。4.裸鼠皮下種植瘤模型顯示miR-30d過表達能夠顯著性促進由DU145和LNCaP形成的移植瘤的成瘤大小和生長速度(P0.05)；相反,miR-30d的表達被抑制后移植瘤成瘤大小比對照組小,且生長速度減慢。免疫組化分析結(jié)果顯示miR-30d能夠顯著性促進移植瘤組織中新生血管指標(biāo)CD31和腫瘤侵襲力指標(biāo)MMP-9的表達水平(P0.05)。5.基因表達譜芯片發(fā)現(xiàn)的差異性表達蛋白總共有1420個,有116個基因同時在LNCaP和DU145細胞株中的差異表達的倍數(shù)≤-2或≥2(miR-30d vs miR-NC),包括3個上調(diào)基因和143個下調(diào)基因。IPA生物信息軟件的KEGG通路分析顯示大部分下調(diào)的差異基因參與了腫瘤相關(guān)的通路,其中包括RAN信號通路(RAN Signaling)、RhoA信號通路、蛋白泛素化酶信號通路、HIF1-a信號通路和腎細胞癌信號通路。IPA生物信息軟件的生物學(xué)功能和相關(guān)疾病分析結(jié)果顯示下調(diào)表達的差異基因參與了細胞功能形態(tài)、細胞運動等腫瘤進展相關(guān)的生物學(xué)功能。6.3個miRNAs靶基因軟件共同預(yù)測116個LNCaP和DU145細胞株共同下調(diào)的基因中可能被miR-30d調(diào)控的候選靶基因,結(jié)果顯示CALD1、TNPO1、 ATP2B1、SEPT7、MYPT1、ZNF148、CEP350、KIF5B、STAG2和GALNT1為候選靶基因。qRT-PCR結(jié)果顯示MYPT1、CEP350、STAG2和GALNT1在穩(wěn)定表達miR-30d的LNCaP和DU145細胞株中表達顯著性下調(diào)(P0.05)在miR-30d過表達的LNCaP細胞株和裸鼠皮下移植瘤組織中表達下調(diào)(P0.05)。熒光素酶報告系統(tǒng)進一步揭示MYPT1是miR-30d直接調(diào)控的靶基因(P0.001)。qRT-PCR和白質(zhì)印跡法證實miR-30d和MYPT1在前列腺癌細胞株和裸鼠皮下種植瘤的基因和蛋白表達存在負相關(guān)的關(guān)系；在Taylor臨床前列腺癌組織芯片數(shù)據(jù)庫中兩者的基因表達水平也呈負相關(guān)的關(guān)系。7.體外細胞功能實驗示MYPT1過表達可以拮抗miR-30d在前列腺癌細胞中產(chǎn)生的HUVEC細胞遷移、侵襲和管腔生成能力的促進作用(P0.05)。這些結(jié)果進一步揭示了MYPT1可能是miR-30d發(fā)揮促進前列腺癌進展作用下游重要的媒介。8.組織芯片免疫染色分析顯示前列腺癌組織標(biāo)本的MYPT1免疫評分顯著低于癌旁良性前列腺組織(P0.001)；MYPT1的低表達與前列腺癌患者的Gleason評分較高(P=0.002)、轉(zhuǎn)移(P=0.018)、生化復(fù)發(fā)(P0.001)和總體生存率降低(P=0.005)有關(guān)。Kaplan-Meier法和Log rank法分析結(jié)果顯示MYPT1的低表達與患者總體無生化復(fù)發(fā)生存率、總體生存率降低、無轉(zhuǎn)移生存率的降低有關(guān)(P值分別為0.001、0.005和0.049)。COX回歸模型顯示MYPT1可作為預(yù)測前列腺癌患者無生化復(fù)發(fā)生存率和無轉(zhuǎn)移生存率的獨立指標(biāo),HR(95%CI)分別是3.339(1.962-5.684)和2.169(0.752-6.260)。同一套芯片上行CD31免疫熒光分析結(jié)果顯示MYPT1在前列腺癌組織中的表達與CD31呈負相關(guān)關(guān)系(RS=-0.457,P0.001),采用Kaplan-Meier法和Logrank法分析,結(jié)果顯示MYPT1低表達同時CD31高表達與患者無生化復(fù)發(fā)生存率、總生存率降低、無轉(zhuǎn)移生存率的降低相關(guān)(P值分別為0.001、0.017和0.008)。COX回歸模型多因素分析顯示MYPT1低表達/CD31高表達是患者無生化復(fù)發(fā)生存率獨立指標(biāo),HR(95%CI)為0.366(0.183-0.734),但不能成為無轉(zhuǎn)移生存率獨立的預(yù)后因子。9.在前列腺癌細胞株LNCaP和DU145中,抑制MYPT1的表達或miR-30d過表達均可以同時導(dǎo)致磷酸化cJUN (ser63)、磷酸化cJUN (ser73)和VEGF的蛋白水平升高,而總cJUN的蛋白水平無明顯變化,這結(jié)果說明cJUN磷酸化激活引起的VEGF表達增加是miR-30d-MYPT1軸影響前列腺癌血管生成的下游重要信號通路。結(jié)論：1.在前列腺癌中,miR-30d作為促癌基因,可通過靶標(biāo)調(diào)控抑制MYPT1的表達促進腫瘤的進展。2. miR-30d和MYPT1均可作為預(yù)測前列腺癌患者根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)風(fēng)險的獨立預(yù)測指標(biāo)；MYPT1還可作為前列腺癌患者根治術(shù)后轉(zhuǎn)移的獨立預(yù)測指標(biāo)。3. MYPT1在臨床前列腺癌中的表達與CD31負相關(guān),miR-30d通過靶向抑制MYPT1的表達促進前列腺癌血管生成,促進前列腺臨床進展和轉(zhuǎn)移。4. miR-30d-MYPT1信號軸對cJUN-VEGF的調(diào)控有望成為臨床治療前列腺癌的新靶標(biāo)。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25

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1 林卓遠;小分子RNA-30d通過靶向調(diào)控MYPT1促進前列腺癌進展和血管生成[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

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本文編號：2407822