【摘要】：研究目的 探討腹腔注射乙醇對小鼠在實驗期間的生長發(fā)育、睪丸指數(shù)以及生精功能的影響，掌握小鼠石蠟切片制備和HE染色等技術(shù)，采用熒光原位末端標(biāo)記法（熒光TUNEL法）檢測睪丸生殖細胞凋亡，實時定量-PCR檢測Caspase-3mRNA的表達，Western-Blot檢測Caspase-3蛋白的表達，初步探討乙醇致睪丸損傷的機制，為長期接觸乙醇或飲酒而致睪丸損傷患者的治療提供了新思路，亦為臨床治療男性不育癥探索新的方向。 研究對象和方法 1.選取24只體重相近的雄性昆明小鼠，隨機分為對照組和實驗組，每組各12只，記錄每只小鼠初始體重。每天給予實驗組小鼠15%的乙醇3g/kg腹腔注射，對照組小鼠腹腔注射等劑量生理鹽水，連續(xù)處理14天，成功建立乙醇致睪丸損傷模型，再記錄每只小鼠體重。 2.采用斷頸法將所有小鼠處死，迅速收集并稱重睪丸標(biāo)本，計算睪丸指數(shù)。其中左側(cè)睪丸置入Bouin’s固定液中保存，右側(cè)睪丸置入液氮罐中超低溫保存。 3.將利用Bouin’s液固定完成的睪丸標(biāo)本制備石蠟包埋并切片，采用HE染色法觀察兩組睪丸曲精細管及生殖細胞形態(tài)學(xué)改變，采用熒光原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測睪丸生殖細胞凋亡，應(yīng)用實時定量-PCR（RT-PCR）檢測Caspase-3mRNA的表達，應(yīng)用蛋白免疫印跡法（Western-Blot）檢測Caspase-3蛋白的表達。 4.采用SPSS l7.0軟件統(tǒng)計處理實驗數(shù)據(jù)，兩組獨立樣本定量資料，同時符合正態(tài)性及方差齊性時采用兩獨立樣本的t檢驗；符合正態(tài)分布但方差不齊時，選用校正的t檢驗（t＇檢驗）；不服從正態(tài)分布時，選用秩和檢驗。選擇檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。 結(jié)果 本實驗采用15%的乙醇3g/kg給予小鼠腹腔注射14天后，成功建立乙醇致小鼠睪丸損傷模型。實驗期間對照組小鼠飲食及活動正常，實驗組小鼠出現(xiàn)亢奮、抓咬等醉酒現(xiàn)象。從乙醇處理前后體重改變來看，實驗組體重增加明顯小于對照組（P=0.03），同時檢測各組小鼠睪丸臟器指數(shù)（睪丸相對于小鼠實驗前的體重），以及光鏡下HE染色曲精細管直徑變化，也得到基本一致的結(jié)果。實驗組睪丸重量和體重的比值低于對照組（P0.05）；HE染色顯示實驗組曲精小管直徑和生殖細胞及精子數(shù)量均有異常改變；采用TUNEL檢測兩組小鼠生殖細胞凋亡指數(shù)，對照組生殖細胞平均凋亡指數(shù)為（0.1219±0.0184），顯著低于實驗組小鼠（0.5732±0.0223）（P0.05）；實時定量PCR結(jié)果顯示實驗組Caspase-3mRNA表達（2-△△Ct=3.35±0.13）顯著高于對照組（2-△△Ct=1）（P0.05）；Western-Blot結(jié)果顯示Caspase-3蛋白表達（IntDen=44.51±8.94）顯著高于對照組（IntDen=140.66±6.25）（P0.05）。 結(jié)論 乙醇對哺乳動物生長發(fā)育、睪丸、生精功能等具有明顯的抑制作用，Caspase-3基因在乙醇對哺乳動物睪丸損傷過程中扮演著重要角色，與生殖細胞的凋亡密切相關(guān)，而乙醇本身或乙醇在體內(nèi)的一些相關(guān)代謝產(chǎn)物可能牽涉到其作用機制，但是尚不能確定，，需要之后多項實驗進一步探討。我們通過本實驗可以確定乙醇對哺乳動物的負性影響，這或許可以讓人們認識到過度飲酒的危害，為長期接觸乙醇或飲酒而致睪丸損傷患者的治療提供了新思路，亦為臨床治療男性不育癥探索新的方向。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R697.22

【參考文獻】

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本文編號：2342123