【摘要】：研究背景： 高血壓腎損害是終末期腎病的重要原因,其中惡性高血壓腎損害更重、進展更快,腎臟1年生存率僅42%-57%。腎小管周毛細血管(Peritubular capillary, PTC)是由腎小球出球動脈分出的腎小管周圍的毛細血管網(wǎng),直接決定小管間質(zhì)的血流,在多種慢性腎臟病中PTC損傷與腎功能損害、腎小管間質(zhì)病變密切相關(guān)。我們前期在原發(fā)惡性高血壓患者中觀察到腎小管周毛細血管PTC嚴重缺失,與腎功能損傷及腎小管間質(zhì)病變程度相關(guān)性較好,是預(yù)測腎臟不良預(yù)后的獨立危險因素,同時還伴有腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)的高度活化。但在高血壓良性腎硬化、慢性腎炎(如IgA腎病)繼發(fā)的惡性高血壓中是否存在類似的現(xiàn)象?尚不得而知。PTC血流由調(diào)節(jié)入球和出球動脈收縮、舒張的血管活性物質(zhì)直接決定,其中收縮出球動脈的RAAS和收縮入球動脈的腺苷及其1型受體(A1adenosine receptor, A1AR)的活化構(gòu)成了致密斑區(qū)域管球反饋的精細平衡。但在高血壓的PTC損傷中,RAAS活化、腺苷及A1AR激活的作用孰輕孰重并不清楚。另一方面,文獻中間質(zhì)的炎癥反應(yīng)(如巨噬細胞浸潤)可能導(dǎo)致PTC血管生成促進因子和抑制因子的失衡,而在腎臟廣泛分布的A1AR,在腎缺血再灌注動物模型中具有抑制腎臟局部炎癥細胞募集的作用,但目前還沒有A1AR在高血壓微血管損傷中抗炎癥作用的研究。因此探討A1AR是否參與高血壓腎損傷尤其是PTC損傷的調(diào)節(jié),其具體機制是經(jīng)典的血流動力學(xué)調(diào)節(jié)作用,還是新的抗炎機制有積極的意義。 研究目的： 1.觀察高血壓(良性腎硬化、原發(fā)和IgA腎病伴惡性高血壓)患者腎臟PTC損傷、巨噬細胞浸潤和腎素活化的特點,分析它們與臨床病理的相關(guān)性； 2.建立高鹽皮質(zhì)激素-低腎素-鹽敏感高血壓(DOCA-salt)小鼠動物模型,觀察PTC缺失與蛋白尿、腎小管功能之間的關(guān)系,分析腺苷及其受體活化、RAAS水平、腎間質(zhì)巨噬細胞浸潤對PTC損傷的意義； 3.在腺苷1型受體基因缺失(A1AR-/-)小鼠中建立DOCA-salt高血壓模型,觀察A1AR對高血壓時腎間質(zhì)巨噬細胞浸潤和PTC損傷的保護作用。 研究方法及結(jié)果： 1.高血壓患者PTC損傷與局部腎素表達、巨噬細胞浸潤無關(guān) 納入2003年1月~2012年3月在北京協(xié)和醫(yī)院臨床病理資料完整的103例高血壓腎損害患者,其中高血壓良性腎硬化17例、IgA腎病伴惡性高血壓34例、原發(fā)惡性高血壓52例,對照為同期經(jīng)腎活檢證實腎臟病理結(jié)構(gòu)接近正常的腎小球輕微病變19例。收集其臨床病理資料,對腎臟病理改變進行半定量評分,行CD34(血管內(nèi)皮特異性標記)、CD68(巨噬細胞標記)和腎素免疫組化染色,觀察到： 1)高血壓患者均存在不同程度的PTC缺失,其程度與腎功能損傷、腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化顯著相關(guān)； 2)高血壓患者均存在腎間質(zhì)巨噬細胞浸潤,并與腎功能損傷、蛋白尿程度、腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化顯著相關(guān),但與PTC相關(guān)性欠佳； 3)高血壓良性腎硬化患者腎臟球旁器腎素表達與腎小球輕微病變組無差異,但惡性高血壓患者腎素顯著增加,腎素表達水平與腎功能、腎臟病理改變和PTC損傷均無關(guān)； 4)與高血壓良性腎硬化患者相比,惡性高血壓患者腎功能損害、PTC缺失及腎間質(zhì)巨噬細胞浸潤均更重。 2.低腎素-鹽敏感高血壓小鼠PTC損傷與巨噬細胞浸潤的關(guān)系 2.1建立高鹽皮質(zhì)激素-低腎素-鹽敏感高血壓(DOCA-salt)小鼠模型麻醉下手術(shù)切除左腎,同時腹腔植入醋酸脫氧皮質(zhì)酮(DOCA)緩釋藥片(200mg,60天緩釋),聯(lián)合高鹽飲食(8%NaCl飼料+含0.9%NaCl±0.2%KCl飲用水)喂養(yǎng),建立鹽敏感高血壓(DOCA-salt)小鼠模型。第0、1、2、4、8w監(jiān)測血壓心率,第0、4、8w收集24h尿標本測尿滲透壓、白蛋白及電解質(zhì)水平。觀察到： DOCA-salt小鼠收縮壓第1w即顯著升高([122.3±9.5]mmHg vs.[113.5±4.7]mmHg,P0.05),并進行性升高至第8w,顯著高于同齡對照組([141.5±10.4]mmHg vs.[104.3±12.5]mmHg, P0.05),同時伴心率明顯減慢。與對照組相比,DOCA-salt小鼠第4、8w尿量分別增加2倍和4倍,尿滲透壓降低約50%,給予血管加壓素后尿滲透壓能恢復(fù)正常；試驗組小鼠尿鈉排出量也顯著增加(5~9倍),尿白蛋白／肌酐比增加數(shù)十倍。 2.2DOCA-salt小鼠RAAS水平、腎間質(zhì)巨噬細胞浸潤與PTC損傷的關(guān)系 建立DOCA-salt鹽敏感高血壓模型后第0、4、8w采集血漿,放免法測定腎素活性(PRA)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和醛固酮(ALD)水平,第4、8w處死時腎臟標本行免疫組化染色觀察PTC缺失(CD34)和腎間質(zhì)巨噬細胞(CD68)浸潤情況,Realtime-PCR方法評價腺苷合成酶CD39±CD73和A1AR mRNA表達水平。觀察到DOCA-salt小鼠： 1)腎臟重量指數(shù)增加,腎臟病理第4w無明顯改變,第8w腎小球周圍出現(xiàn)腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化； 2)PTC面積顯著低于同齡對照小鼠(4w:[2.62±0.34]%vs.[4.57±0.79]%, P=0.004;8w:[2.57±0.20]%vs.[3.41±0.48]%,P=0.018),并與白蛋白尿(4w)、尿量增加(8w)相關(guān)(P0.05)；單腎切除對照小鼠第8w PTC面積較第4w也有所減少； 3)腎間質(zhì)巨噬細胞浸潤隨周齡增加而加重,均高于同齡對照組小鼠(4w:[7.28±3.46]個/mm2vs.[0.46±0.29]個/mm2, P=0.008;8w:[24.87±12.13]個/mm2vs.[0.54±0.74]個/mm2.P=0.028),但與PTC損傷無關(guān)； 4)PRA水平進行性減低,低于同齡對照組小鼠,減低程度與尿量增加相關(guān)(r=0.983,P=0.017),但與PTC面積無關(guān)；AngⅡ和ALD水平無顯著改變； 5)第4、8w腎臟腺苷合成酶CD73±CD39mRNA表達水平分別是對照組的2.22倍(P=-0.034)和5.36倍(P=-0.005),與蛋白尿、血壓和尿量有不同程度的相關(guān)性；A1AR mRNA表達水平是對照的2.54倍(P=-0.032)。 3.腺苷1型受體在高血壓PTC損傷中的作用 引進腺苷1型受體(A1AR)基因敲除雜合小鼠進行配種、繁殖和基因鑒定。在A1AR-／-小鼠中復(fù)制DOCA-salt鹽敏感高血壓模型,第4w處死,標本留取及觀察評價方法同第二部分。 A1AR-/-小鼠單腎切除后收縮壓高于野生型對照小鼠,而建立DOCA-salt模型后無進一步升高。與野生型DOCA-salt小鼠相比,A1AR-/-DOCA-salt小鼠尿量更多([7003±3742]μl vs.[3606±2359]μl,P=0.031),腎小管間質(zhì)損害出現(xiàn)更早(第4w),PTC面積更少([2.134-0.17]%vs.[2.62±±0.34]%,P=0.042),而血漿。腎素水平和腎間質(zhì)巨噬細胞浸潤與野生型DOCA-salt小鼠無差異。 研究小結(jié)和結(jié)論： 在本研究條件下觀察到 1.高血壓患者均有不同程度的PTC缺失和腎間質(zhì)巨噬細胞浸潤,二者均與腎小管間質(zhì)病理改變有良好的相關(guān)性；高血壓良性腎硬化患者腎臟球旁器腎素表達與腎小球輕微病變組無差異,和腎功能及腎小管間質(zhì)病理改變無關(guān)；PTC缺失與巨噬細胞浸潤、腎素高表達無關(guān)； 2.高鹽皮質(zhì)激素-低腎素-鹽敏感高血壓小鼠,第1周血壓升高,隨后出現(xiàn)明顯的PTC缺失,伴有白蛋白尿和尿液濃縮功能障礙,同時腺苷合成酶CD73mRNA表達水平增加,隨后(建模第8w)才出現(xiàn)明顯的腎間質(zhì)巨噬細胞浸潤和間質(zhì)纖維化； 3. A1AR-/-小鼠建立鹽敏感高血壓模型后,與野生型DOCA-salt小鼠相比,血壓并不進一步增加,但PTC損傷更重,腎小管間質(zhì)病理改變出現(xiàn)更早,而腎間質(zhì)巨噬細胞浸潤無加重。 由此可見,高血壓的PTC損傷普遍存在,并與白蛋白尿、小管間質(zhì)損傷密切相關(guān),其機制可能與醛固酮的直接作用和腎小球的高灌注、高壓力有關(guān),其中腺苷及A1AR通過管球反饋起到保護作用,與間質(zhì)巨噬細胞浸潤和高腎素?zé)o關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R692;R544.1

【參考文獻】

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本文編號：2342361