【摘要】：近年來一些研究顯示microRNAs(miRNAs)在糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)發(fā)病中起重要作用，這種小RNA分子能以不完全互補(bǔ)的方式與其靶mRNA的3'非編碼區(qū)（untranslatedregions，UTR）特異性結(jié)合阻斷mRNA的翻譯或抑制該mRNA的蛋白合成，從而影響基因的表達(dá)調(diào)控，但是具體機(jī)制尚不清楚。而AGEs（advancedglycationendproducts，AGEs）做為DN的重要發(fā)病機(jī)制之一，其對miRNA表達(dá)情況無人研究。本實驗首先采用miRNA芯片技術(shù)檢測給予AGEs的大鼠腎臟miRNAs表達(dá)譜的變化，RealTime-PCR驗證變化明顯的miRNAs，最終確定miRNA的靶基因并闡明miRNA及其靶基因的作用機(jī)理。旨在從miRNA的角度探討糖基化糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）在大鼠DN發(fā)病中的作用。 實驗一AGEs動物腎損傷模型的構(gòu)建 采集正常大鼠血液分離血清，分別制成糖化血清（AGEs）和單純血清（RSA）。實驗大鼠隨機(jī)分成3組：正常對照組（Control組）不施加任何處理；單純血清組（RSA組）動物每日尾靜脈注射單純血清100mg/kg/次；AGEs組動物每日尾靜脈注射AGEs100mg/kg/次，6w后檢測各組大鼠腎損傷情況。結(jié)果顯示RSA組與control組比較24h尿蛋白排泄率及腎組織結(jié)構(gòu)無明顯變化。AGEs組大鼠24h尿蛋白排泄率較RSA組和Control組有增高趨勢，并且組織病理檢查顯示腎小球系膜細(xì)胞有輕度增生現(xiàn)象，，腎小球區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)有增多及局部集聚的改變，提示AGEs組腎臟已開始出現(xiàn)類似DN的病變。 實驗二miRNA芯片初篩腎組織miRNA表達(dá)譜及Realtime-PCR驗證 本部分實驗我們首先根據(jù)大鼠尿蛋白排泄率（UAE）結(jié)果挑選三只AGEs組及RSA組大鼠腎皮質(zhì)部分進(jìn)行miRNA芯片檢測，初步篩查miRNAs表達(dá)譜變化，接下來挑選變化明顯的miRNAs依次輸入miRBase數(shù)據(jù)庫，獲取相應(yīng)的miRNA序列信息和相關(guān)注釋，再依次輸入TargetScan數(shù)據(jù)庫即可找到miRNA對應(yīng)的靶基因（靶基因分為保守性和非保守型），我們根據(jù)與DN發(fā)病密切相關(guān)的細(xì)胞因子，鎖定幾個變化明顯的miRNA，最后并利用realtime-PCR進(jìn)行驗證得出選定的miRNA。 根據(jù)芯片結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，AGEs組和RSA檢測共出9個表達(dá)譜變化明顯的miRNAs(p0.05)，分別為miRNA-7d-3p，miRNA-92b-3p，miRNA-181b-5p，miRNA-196c-5p，miRNA-7a-1-3p，miR-186-5p，miRNA-192-5P，miRNA-196b-5p和miRNA-345-5p，其中miRNA-92b-3p變化最明顯且（p0.01）。其次還有20多個miRNA的表達(dá)譜兩組間也有差別（p0.10），分別為miRNA-7c-1-3p，miRNA-129-5p，miRNA-7d-3p，miRNA-375-3p，miRNA-92b-3p，miRNA-7b-3p，miRNA-196b-5p，miRNA-181b-5p，miRNA-187-3p，miRNA-196c-5p，miRNA-1306-3，miRNA-411-3p，miRNA-126a-3p，miRNA-301a-3p，miRNA-339-5p,miRNA-186-5p，miRNA-192-5p，miRNA-582-5p，miRNA-200a-5p，miRNA-196a-5p，miRNA-345-5p，miRNA-140-5p，miRNA-872-3p，miRNA-7a-1-3p，miRNA-19b-3p，miRNA-466c-3p，miRNA-3584-5p，其中miRNA-196b-5p，miRNA-7d-3p，miRNA-126a-3p為高豐度miRNA（信號500）。除去以上30多個變化有統(tǒng)計學(xué)意義的miRNAs之外，miRNA-21-5p、miRNA-30b-3p、miRNA-30b-5p、miRNA-140-3p等幾個與DN發(fā)病關(guān)系比較密切的miRNAs在兩組間也有變化趨勢（p0.10）。可見大鼠腎臟miRNA表達(dá)譜在AGEs的作用下發(fā)生了變化，并且?guī)讉�經(jīng)與DN發(fā)病關(guān)系比較密切的miRNA-21-5p、miRNA-192-5P也出現(xiàn)了變化。 實驗三靶基因的預(yù)測及驗證 本部分實驗我們首先利用miRNA靶基因預(yù)測軟件(Targetscan、PicTar、miRanda)預(yù)測miRNA-92b-3p的靶基因，確定目標(biāo)研究基因為smad7，隨后免疫組化、WesternBlot進(jìn)一步驗證實驗動物不同組別腎組織靶基因smad7的表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示，與RSA組及control組比較，AGEs組腎臟的腎小球中細(xì)胞核和細(xì)胞漿的Smad7的含量明顯減少。Western結(jié)果顯示與Control組比較RSA組腎小球Smad7表達(dá)無明顯變化，而AGEs組Smad7表達(dá)灰度值明顯減少，結(jié)果提示Smad7可能是miRNA-92b-3p的靶基因之一。 結(jié)論： 1給予AGEs的大鼠腎臟miRNAs表達(dá)譜發(fā)生變化，其中30多個miRNAs表達(dá)譜兩組間存在差異。 2給予AGEs的大鼠腎臟miR-92b-3p表達(dá)明顯升高，Smad7蛋白表達(dá)降低。 3Smad7可能是miRNA-92b-3p的靶基因之一。 提示AGEs可能通過上調(diào)miR-92b-3p的表達(dá)進(jìn)而抑制下游靶基因Smad7蛋白的表達(dá)，參與DN的發(fā)病過程。 創(chuàng)新點： 1首次從miRNAs的角度探討AGEs在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用。 2首次提出Smad7可能是miRNA-92b-3p的靶基因之一。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R587.2;R692

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2325257