【摘要】：目的：本研究擬以狼瘡性腎炎(lupus nephrits,LN)模型MRL/faslpr小鼠和小鼠系膜細(xì)胞為研究對象，探討高遷移率族蛋白（high mobility groupprotein B1,HMGB1）及其相關(guān)信號通路在狼瘡性腎炎腎小球系膜細(xì)胞增殖中的作用及其可能作用機(jī)制，并應(yīng)用電穿孔技術(shù)進(jìn)行小鼠活體轉(zhuǎn)染，觀測敲低HMGB1及其相關(guān)信號通路因子的表達(dá)對小鼠腎臟損傷和腎功能改善情況，為狼瘡性腎炎的病因研究和靶向治療提供依據(jù)。 方法： 1檢測HMGB1，PCNA和TLR2在MRL/faslpr小鼠腎組織的表達(dá) 28周齡雄性MRL/MPJ小鼠和MRL/faslpr小鼠（體重：45-55g）各8只，分別設(shè)為對照組（Control組）和狼瘡性腎炎組（LN組）。留取24h尿液及內(nèi)眥動(dòng)脈取血后處死小鼠，取腎臟皮質(zhì)，部分置于4%多聚甲醛固定，用于光鏡檢測；部分置于液氮保存，用于冰凍切片和腎小球目的蛋白及RNA水平檢測。常規(guī)病理染色技術(shù)觀察腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)；免疫熒光技術(shù)和Western blot檢測腎皮質(zhì)HMGB1、PCNA和TLR2蛋白的表達(dá)；顯微切割技術(shù)提取腎小球組織，Real-time PCR檢測腎小球HMGB1、PCNA和TLR2mRNA的表達(dá)；雷諾RT-9600半自動(dòng)生化分析儀檢測Scr、BUN和24h蛋白尿生化指標(biāo)。 2敲低MRL/faslpr小鼠腎皮質(zhì)HMGB1的表達(dá)對小鼠腎臟增殖水平及腎功能的影響 ⑴以小鼠系膜細(xì)胞為研究對象，脂質(zhì)體介導(dǎo)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染shHMGB1質(zhì)粒，Western blot和Real-time PCR檢測shHMGB1質(zhì)粒對小鼠系膜細(xì)胞HMGB1蛋白及mRNA表達(dá)水平的抑制作用。⑵28周齡雄性MRL/MPJ小鼠（體重：45-55g）6只設(shè)為對照組（Control組），18只等周齡等體重MRL/faslpr雄性小鼠隨機(jī)分為狼瘡性腎炎組（LN組），shNC干預(yù)組（LN+shNC組）和shHMGB1干預(yù)組（LN+shHMGB1組）。電穿孔技術(shù)向治療組小鼠腎臟皮質(zhì)轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒。2周后留取24h尿液和內(nèi)眥動(dòng)脈取血后處死小鼠取腎臟皮質(zhì)，部分置于4%多聚甲醛固定，用于常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測；部分皮質(zhì)置于液氮保存，用于冰凍切片和腎皮質(zhì)蛋白檢測。常規(guī)病理染色技術(shù)檢測小鼠組織形態(tài)結(jié)構(gòu)；免疫熒光檢測腎小球內(nèi)HMGB1和PCNA蛋白的表達(dá)；Western blot和Real-time PCR檢測腎皮質(zhì)中HMGB1和PCNA蛋白及mRNA表達(dá)水平；雷諾RT-9600半自動(dòng)生化分析儀檢測Scr、BUN和24h蛋白尿生化指標(biāo)。 3檢測HMGB1對體外培養(yǎng)小鼠系膜細(xì)胞增殖水平的影響及其作用機(jī)制 小鼠系膜細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下，以含10%胎牛血清的DMEM/F12(3:1)培養(yǎng)基培養(yǎng)。⑴為了探討HMGB1對細(xì)胞增殖的影響，將細(xì)胞分別以50μg.L-1、100μg.L-1和200μg.L-1HMGB1刺激2、4、8和12h，并于收集細(xì)胞前1h加入10μmol.L-1BrdU，以ELISA技術(shù)檢測小鼠系膜細(xì)胞的增殖水平。⑵根據(jù)⑴的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將MMC細(xì)胞隨機(jī)分為對照組和100μg.L-1HMGB1刺激組，分別于刺激10min、20min、30min、40min、50min和1h時(shí)收集細(xì)胞，Western blot檢測p85、p110、p-Aktser473、Akt、p-IκBa和IκBa蛋白的表達(dá)水平，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測NF-κB p65核轉(zhuǎn)位情況。⑶細(xì)胞隨機(jī)分為Control組、HMGB1刺激組、LPS+HMGB1組和TLR2AB（block antibody）+LPS+HMGB1組，先后加入5μg.mL-1TLR2AB(blockantibody)孵育1h，5μg.mL-1LPS孵育2h，100μg.L-1HMGB1或DMSO，繼續(xù)孵育8h，并于收集細(xì)胞前1h加入10μmol.L-1BrdU，Western blot和Real-time PCR檢測PCNA蛋白和mRNA表達(dá)情況，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測BrdU表達(dá)情況。⑷細(xì)胞隨機(jī)分為Control組和HMGB1刺激組，100μg.L-1HMGB1孵育10min，免疫共沉淀結(jié)合Western blot檢測TLR2蛋白和p85蛋白結(jié)合水平。⑸細(xì)胞隨機(jī)分為Control組，HMGB1刺激組，LY294002+HMGB1組和DMSO+HMGB1組，先后加入30μmol.L-1LY294002或DMSO孵育1h和100μg.L-1HMGB1孵育8h，并于收集細(xì)胞前1h加入10μmol.L-1BrdU，Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測細(xì)胞增殖水平；或先后加入或不加30μmol.L-1LY294002孵育1h和100μg.L-1HMGB1孵育50min，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測NF-κB p65核轉(zhuǎn)位水平。⑹細(xì)胞隨機(jī)分為Control組， HMGB1刺激組， PDTC+HMGB1組和DMSO+HMGB1組，先后加入或不加30μmol.L-1PDTC孵育1h和100μg.L-1HMGB1孵育8h，并于收集細(xì)胞前1h加入10μmol.L-1BrdU，Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測細(xì)胞增殖水平；或先后加入或不加30μmol.L-1PDTC孵育1h和100μg.L-1HMGB1孵育30min，Western blot檢測p-Aktser473表達(dá)水平。⑺細(xì)胞隨機(jī)分為Control組和HMGB1刺激組，100μg.L-1HMGB1孵育90min，染色質(zhì)免疫共沉淀檢測NF-κB p65蛋白和CylinD1啟動(dòng)子序列的結(jié)合水平。 4敲低MRL/faslpr小鼠腎組織TLR2或Akt的表達(dá)對小鼠腎臟增殖水平及蛋白尿水平的影響 ⑴以小鼠系膜細(xì)胞為研究對象，脂質(zhì)體介導(dǎo)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染shTLR2或shAkt質(zhì)粒，Western blot和Real-time PCR檢測質(zhì)粒對小鼠系膜細(xì)胞TLR2或Akt蛋白及mRNA表達(dá)水平的抑制作用。⑵28周齡雄性MRL/MPJ小鼠（體重：45-55g）6只設(shè)為對照組（Control組），18只等周齡等體重MRL/faslpr雄性小鼠隨機(jī)分為狼瘡性腎炎組（LN組），shNC干預(yù)組（LN+shNC組）組和shTLR2干預(yù)組（LN+shTLR2組）或shAkt干預(yù)組（LN+shAkt組）。電穿孔技術(shù)向治療組小鼠腎臟皮質(zhì)轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒。2周后留取24h尿液和內(nèi)眥動(dòng)脈取血后處死小鼠取腎臟皮質(zhì)，部分置于4%多聚甲醛固定，用于常規(guī)病理學(xué)染色技術(shù)檢測；部分皮質(zhì)置于液氮保存，用于冰凍切片和腎皮質(zhì)蛋白檢測。HE染色檢測小鼠組織形態(tài)結(jié)構(gòu)；免疫熒光檢測腎小球內(nèi)PCNA和TLR2或Akt蛋白的表達(dá)；Western blot和Real-time PCR檢測腎小球中PCNA和TLR2或Akt蛋白及mRNA表達(dá)水平；雷諾RT-9600半自動(dòng)生化分析儀檢測Scr、BUN、尿白蛋白生化指標(biāo)。 結(jié)果： 1HMGB1、PCNA和TLR2在MRL/faslpr小鼠腎小球的表達(dá)上調(diào) ⑴光鏡觀察：與Control組相比，LN組小鼠腎小球體積增大，細(xì)胞數(shù)目增多。⑵免疫熒光檢測顯示，在Control組小鼠腎小球中，HMGB1只表達(dá)于細(xì)胞核中，而在LN組小鼠腎組織中HMGB1則同時(shí)表達(dá)于腎小球細(xì)胞的胞核和核外； PCNA陽性信號在Control組和LN組小鼠腎小球中都主要定位于細(xì)胞核，但在后者的表達(dá)強(qiáng)于前者；TLR2在Control組小鼠腎小球中無明顯表達(dá)，而在LN組腎小球中出現(xiàn)明顯的陽性表達(dá)，且陽性信號呈系膜狀呈現(xiàn)。⑶Western blot結(jié)果表明，與Control組相比，LN組小鼠腎皮質(zhì)HMGB1、PCNA和TLR2蛋白的相對表達(dá)量顯著升高。⑷Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，與Control組相比，LN組小鼠腎小球HMGB1、PCNA和TLR2mRNA的表達(dá)水平均明顯升高。⑷腎功能：與正常組相比，狼瘡組小鼠24h蛋白尿水平升高，而Scr和BUN變化不明顯。 2敲低HMGB1表達(dá)有效降低MRL/faslpr小鼠腎小球增殖水平及蛋白尿水平 ⑴shHMGB1質(zhì)粒能夠有效下調(diào)小鼠系膜細(xì)胞中HMGB1蛋白及mRNA表達(dá)水平：Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，shHMGB1組小鼠系膜細(xì)胞的HMGB1蛋白的表達(dá)水平明顯降低； Real-time PCR結(jié)果顯示，shHMGB1組小鼠系膜細(xì)胞的HMGB1mRNA水平較Control組均明顯下調(diào)。⑵活體電穿孔技術(shù)可有效的將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠腎皮質(zhì)：冰凍切片熒光顯微鏡下觀察結(jié)果提示，電穿孔轉(zhuǎn)染后1天、7天和14天目的質(zhì)粒在小鼠腎皮質(zhì)均有熒光表達(dá)，其中第7天時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，第14天表達(dá)較低。⑶shHMGB1質(zhì)粒有效下調(diào)狼瘡模型小鼠HMGB1蛋白和mRNA的表達(dá)：免疫熒光檢測結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，shHMGB1組小鼠腎小球HMGB1蛋白的表達(dá)明顯降低，且主要定位于細(xì)胞核；Western blot結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，shHMGB1組小鼠腎皮質(zhì)中HMGB1蛋白的表達(dá)水平明顯降低；Real-time PCR結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，shHMGB1組小鼠腎小球的HMGB1mRNA表達(dá)水平明顯降低。⑷敲低腎組織中HMGB1表達(dá)能夠降低狼瘡模型小鼠腎小球細(xì)胞增殖水平：肉眼觀察，各組小鼠腎臟體積、質(zhì)量均無明顯變化。光鏡下觀察，與LN組相比，LN+shHMGB1組小鼠腎小球細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目有所減少，但仍高于Control組；免疫熒光檢測結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，shHMGB1組小鼠腎小球PCNA蛋白的表達(dá)明顯降低；Western blot結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，shHMGB1組小鼠腎皮質(zhì)中PCNA蛋白的表達(dá)水平明顯降低；Real-timePCR結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，shHMGB1組小鼠腎小球的PCNAmRNA表達(dá)水平明顯降低。⑸沉默腎組織中HMGB1表達(dá)能夠降低狼瘡性腎炎模型小鼠蛋白尿水平：生化檢測結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，shHMGB1組小鼠24h蛋白尿量出現(xiàn)明顯的降低，血肌酐和血尿素水平無明顯差別。 3HMGB1通過PI3K/Akt/NF-Κb/Cylin D1信號通路上調(diào)體外培養(yǎng)小鼠系膜細(xì)胞的增殖水平 ⑴HMGB1能夠上調(diào)小鼠系膜細(xì)胞增殖水平：BrdU摻入法ELISA技術(shù)檢測結(jié)果顯示，100μg.L-1HMGB1或200μg.L-1HMGB1刺激2h后，系膜細(xì)胞增殖水平均逐漸升高，并于8h達(dá)到高峰，12h逐漸降低；50μg.L-1HMGB1各時(shí)間點(diǎn)對系膜細(xì)胞的促增殖作用均低于100μg.L-1HMGB1組；而100μg.L-1HMGB1和200μg.L-1HMGB1兩組之間HMGB1作用8h細(xì)胞增殖水平無明顯差別。⑵HMGB1的促增殖作用是TLR2依賴性的： BrdU摻入法細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示，與Control組相比，HMGB1刺激組系膜細(xì)胞中BrdU陽性表達(dá)率明顯增高；與HMGB1刺激組相比， LPS+HMGB1組BrdU陽性細(xì)胞比例顯著增加，而TLR2中和抗體能夠降低BrdU陽性細(xì)胞比例。⑶HMGB1上調(diào)TLR2與p85蛋白的結(jié)合：免疫共沉淀結(jié)合Western blot結(jié)果提示，Control組TLR2與p85無明顯結(jié)合，HMGB1刺激5min后，檢測到較明顯與TLR2結(jié)合的p85蛋白條帶。⑷HMGB1能夠激活小鼠系膜細(xì)胞的PI3K/Akt/NF-κB信號通路：Western blot結(jié)果顯示，HMGB1刺激30min時(shí)，p-Aktser473蛋白表達(dá)水平瞬時(shí)升高，同時(shí)，p-IκBa表達(dá)水平升高，而IκBa表達(dá)開始降低；細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示，正常細(xì)胞NF-κBp65主要定位于細(xì)胞漿，HMGB1刺激50min后，NF-κBp65主要在細(xì)胞核表達(dá)。⑸HMGB1所介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)位的NF-κBp65與Cyclin D1啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合增強(qiáng)：染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果提示，HMGB1刺激90min后，PCR檢測到明顯的與NF-κBp65結(jié)合的Cylin D1DNA。⑹LY294002和PDTC均能夠抑制HMGB1對小鼠系膜細(xì)胞的增殖作用：BrdU摻入法細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示，與HMGB1組相比，LY294002+HMGB1組和PDTC+HMGB1組BrdU陽性細(xì)胞比例降低，Western blot和Real-time PCR結(jié)果顯示，與HMGB1組相比，LY294002+HMGB1組和PDTC+HMGB1組PCNA和Cyclin D1蛋白和mRNA表達(dá)水平降低。⑺LY294002能夠部分抑制NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位而PDTC對Akt活化水平無明顯影響：免疫熒光結(jié)果顯示，與HMGB1組相比，LY294002+HMGB1組NF-κBp65蛋白在系膜細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)降低，定位于胞漿和胞核。Western blot結(jié)果提示，PDTC+HMGB1組p-Aktser473表達(dá)水平與HMGB1組無明顯區(qū)別。 4敲低TLR2表達(dá)有效降低MRL/faslpr小鼠腎小球增殖水平及蛋白尿水平，敲低Akt則對腎小球增殖水平及蛋白尿水平無明顯影響 ⑴shTLR2質(zhì)�？捎行抡{(diào)小鼠系膜細(xì)胞和腎組織中TLR2蛋白和mRNA水平：Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，shTLR2組小鼠系膜細(xì)胞的TLR2蛋白的表達(dá)水平明顯降低；Real-time PCR結(jié)果顯示，shTLR2組小鼠系膜細(xì)胞的TLR2mRNA水平明顯將低。⑵shTLR2質(zhì)粒能夠降低腎組織中TLR2蛋白和mRNA表達(dá)：免疫熒光檢測結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shTLR2組小鼠腎小球的TLR2的表達(dá)水平明顯降低；Western blot結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shTLR2組小鼠腎皮質(zhì)TLR2蛋白表達(dá)明顯降低；Realtime-PCR結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，shTLR2組小鼠腎小球的TLR2mRNA表達(dá)水平均明顯降低。⑶沉默腎組織中TLR2表達(dá)可降低腎小球細(xì)胞增殖：肉眼觀察，各組小鼠腎臟體積、質(zhì)量均無明顯變化。但光鏡下觀察，與LN組相比，LN+shTLR2組小鼠腎小球細(xì)胞數(shù)目有所減少，但仍高于Control組；免疫熒光檢測結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shTLR2組小鼠腎小球的PCNA同樣表達(dá)于細(xì)胞核，但表達(dá)水平明顯降低；Western blot結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shTLR2組小鼠腎皮質(zhì)PCNA蛋白表達(dá)明顯降低；Realtime-PCR結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，shTLR2組小鼠腎小球的PCNAmRNA表達(dá)水平均明顯降低。⑷沉默腎組織中TLR2表達(dá)能夠有效降低小鼠蛋白尿水平：生化檢測結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shTLR2組小鼠的24h蛋白尿量出現(xiàn)降低，血肌酐和血尿素?zé)o明顯差別。⑸shTLR2質(zhì)粒對小鼠腎皮質(zhì)p-Aktser473表達(dá)水平無明顯影響：免疫熒光檢測結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shTLR2組小鼠腎小球p-Aktser473蛋白表達(dá)水平無明顯變化。⑹shAkt質(zhì)粒可有效下調(diào)小鼠系膜細(xì)胞中Akt蛋白和mRNA水平：Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，shAkt組小鼠系膜細(xì)胞的Akt蛋白的表達(dá)水平明顯降低；Real-time PCR結(jié)果顯示，shAkt組小鼠系膜細(xì)胞的Ak tmRNA水平明顯將低。⑺shAkt質(zhì)粒能夠降低腎組織中Akt蛋白和mRNA表達(dá)：免疫熒光檢測結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shAkt組小鼠腎小球的Akt的表達(dá)水平明顯降低；Western blot結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shAkt組小鼠腎皮質(zhì)Akt蛋白表達(dá)明顯降低；Realtime-PCR結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，shAkt組小鼠腎小球的AktmRNA表達(dá)水平均明顯降低。⑻shAkt對小鼠腎小球增殖水平無明顯改善：肉眼觀察，各組小鼠腎臟體積，質(zhì)量均無明顯變化。光鏡下觀察，LN組和LN+shAkt組小鼠腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯改善；免疫熒光檢測結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shAkt組小鼠腎小球的PCNA蛋白表達(dá)水平無明顯改變；Western blot結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，LN+shAkt組小鼠腎皮質(zhì)PCNA蛋白表達(dá)水平無明顯改變；Realtime-PCR結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，shAkt組小鼠腎小球PCNAmRNA表達(dá)水平無明顯改變。⑼shAkt質(zhì)粒對小鼠蛋白尿水平無明顯影響：生化檢測結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比， LN+shAkt組小鼠的24h蛋白尿量、血肌酐和血尿素均未出現(xiàn)明顯差別。 結(jié)論： 1與正常對照組MRL/MPJ小鼠相比，，狼瘡性腎炎模型MRL/faslpr小鼠腎組織中HMGB1、PCNA和TLR2的表達(dá)水平明顯升高，而采用電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默腎組織中HMGB1和TLR2表達(dá)能夠降低腎小球細(xì)胞增殖水平和24h蛋白尿水平，提示HMGB1可能通過TLR2相關(guān)途徑上調(diào)系膜細(xì)胞增殖水平從而參與狼瘡性腎炎發(fā)生的。 2HMGB1可以上調(diào)體外小鼠系膜細(xì)胞的增殖水平，TLR2參與了促增殖過程，而PI3K/Akt/NF-κB/CylinD1信號通路被激活；TLR2抑制可有效的阻滯HMGB1的促增殖作用及PI3K/Akt/NF-κB/Cylin D1信號通路的活化；LY294002和PDTC均可阻滯HMGB1的促增殖作用，同時(shí)LY294002有效阻斷HMGB1引起的p65的核轉(zhuǎn)位，而PDTC對HMGB1引起的PI3K/Akt活化無明顯影響；提示HMGB1在體外通過與其受體TLR2結(jié)合激活PI3K/Akt/NF-κB/Cylin D1信號通路，推動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)系膜細(xì)胞增生。 3電穿孔技術(shù)可有效介導(dǎo)目的質(zhì)粒在狼瘡性腎炎模型小鼠腎臟的活體轉(zhuǎn)染并可維持質(zhì)粒的較長時(shí)間表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R593.242

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2288717