【摘要】：研究背景腎損傷分子-1(Kidney Injury Molecular-1, KIM-1),也被稱(chēng)為T(mén)細(xì)胞免疫球蛋白及粘蛋白1(T cell Ig and Mucin-1,TIM-1)或A型肝炎病毒的細(xì)胞受體-1(A virus cellular receptor-1,Havcr-1)是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白基因超家族。KIM-1在正常腎組織中檢測(cè)不到,而在急性受損后的近曲小管上皮細(xì)胞頂端表面顯著表達(dá)。作為一個(gè)非髓性磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)的受體,KIM-1胞外域能結(jié)合并內(nèi)化氧化的脂質(zhì)體,以及管腔凋亡細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸。通過(guò)這種方式,KIM-1能輔助清除管腔中的細(xì)胞碎片,促進(jìn)腎小管的修復(fù)與組織再造。近年來(lái)研究表明,KIM-1也在多種慢性腎臟病的動(dòng)物模型表達(dá)上調(diào),包括蛋白質(zhì)過(guò)載腎病,阿霉素腎病,血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的腎損傷和小鼠多囊腎,其表達(dá)與纖維化和炎癥區(qū)域重疊。在人類(lèi)慢性腎臟病中,KIM-1表達(dá)上調(diào)與人類(lèi)同種異體移植腎間質(zhì)纖維化直接相關(guān)。在急性腎損傷(Acute Kidney Injury, AKI)及其衍發(fā)地慢性腎臟疾病(Chronic Kidney Disease, CKD)中KIM-1表達(dá)與炎癥和纖維化區(qū)域高度重疊,其流行病學(xué)關(guān)聯(lián)研究表明,KIM-1可能在連接急性腎損傷向慢性腎病和腎纖維化演變中發(fā)揮重要作用。同樣,在腎組織特異性過(guò)表達(dá)KIM-1的轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)腎小管損害,腎單位減少數(shù)量,纖維化,高死亡率和心肌肥厚。KIM-1能迅速、靈敏、特異地反映各種腎臟疾病的損傷及恢復(fù)過(guò)程,已成為一種檢測(cè)早期腎損傷的可靠生物學(xué)標(biāo)記物在臨床上廣泛應(yīng)用,然而其在腎臟疾病中發(fā)生發(fā)展中的病理生理作用仍然不是很明確。 斑馬魚(yú)(zebrafish),熱帶淡水魚(yú)的一種,已經(jīng)成為一個(gè)好的脊椎動(dòng)物模型,應(yīng)用于人類(lèi)疾病,遺傳學(xué)和生長(zhǎng)發(fā)育的研究。大約70%的人類(lèi)疾病基因,在結(jié)構(gòu)和功能上與斑馬魚(yú)高度同源。由于斑馬魚(yú)的腎臟結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單,包括幼蟲(chóng)時(shí)期的前腎及成魚(yú)時(shí)期發(fā)展的中腎,斑馬魚(yú)已成為一種非常流行的研究模型,用于急性腎損傷,多囊腎(Polycystic Kidney Disease, PKD),腎小球腎炎和一系列小管纖毛疾病的研究。同時(shí),斑馬魚(yú)繁殖發(fā)育迅速,易于基因改造及其光學(xué)透明性,使其成為探討及研究KIM-1介導(dǎo)的急性和慢性腎臟改變的理想模型。 在這項(xiàng)研究中,通過(guò)使用基因組及生物進(jìn)化分析,我們發(fā)現(xiàn)并證明了斑馬魚(yú)Kim-1基因家族由zKim-1, zKim-3和zKim-4組成。zKim-1的結(jié)構(gòu)和功能與哺乳動(dòng)物KIM-1高度同源。通過(guò)創(chuàng)建腎小管上皮細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)Kim-1斑馬魚(yú)模型及Cre介導(dǎo)地可調(diào)節(jié)性腎小管上皮細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)Kim-1斑馬魚(yú)模型,我們證實(shí)持續(xù)性過(guò)表達(dá)KIM-1在腎小管上皮細(xì)胞中的病理生理作用。 第一章zKim家族基因序列對(duì)比及zKim-1剪接變體鑒定 目的在斑馬魚(yú)全基因組中尋找Kim家族系列基因,探討Kim家族系列基因在斑馬魚(yú)基因組中的分布情況,為Kim-1蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)奠定分子基礎(chǔ)。 方法在多種公共蛋白及cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索Kim家族基因序列,如Ensembl人類(lèi)基因組瀏覽器(Ensembl Genome Browser, http://useast.ensembl.org/Daniorerio/Info/Index) GenBank,美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)以及UCSC基因組瀏覽器(UCSC Genome Browser, http://genome.ucsc.edu)等。采用不同的同源性基因比對(duì)程序,篩選與人類(lèi)及哺乳動(dòng)物的KIM家族基因序列同源相似性程度較高的斑馬魚(yú)KIM家族基因序列。通過(guò)cDNA基因序列,蛋白質(zhì)編碼序列及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能比對(duì)情況,確定Kim家族系列基因。通過(guò)對(duì)目的基因cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE),確定zKim-1可能存在的剪接變體。 結(jié)果應(yīng)用NCBI/BLAST項(xiàng)目,從EMBL, Genbank and UCSC數(shù)據(jù)中,找到并證實(shí)了zKim-1(EMBL accession number ENSDARG00000091692), zKim-3(ENSDARG00000077257), and zKim-4(ENSDARG00000040178)三個(gè)Kim家族基因,位于21號(hào)染色體。其系統(tǒng)同源性分析表明zKim-1, zKim-3, zKim-4分別與hKIM-1, hKIM-3, hKIM-4在序列及結(jié)構(gòu)上高度同源。cDNA末端快速擴(kuò)增結(jié)果顯示zKim-1存在的三個(gè)剪接變體,分別命名為長(zhǎng)鏈zKim-1(zKim-1-L),短鏈zKim-1(zKim-1-S)及免疫球蛋白zKim-1(zKim-1-Ig)。 結(jié)論1.首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)KIM家族基因在斑馬魚(yú)全基因組的分布情況。2.斑馬魚(yú)KIM家族基因序列具有與人類(lèi)KIM家族基因序列高度同源性。3.蛋白結(jié)構(gòu)上,斑馬魚(yú)KIM家族基因同樣具有胞外信號(hào)肽,免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域,粘蛋白結(jié)構(gòu)域及胞內(nèi)區(qū)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。4.zKim-1存在的三個(gè)剪接變體,即長(zhǎng)鏈zKim-1(zKim-1-L),短鏈zKim-1(zKim-1-S)及免疫球蛋白zKim-1(zKim-1-Ig)。 第二章zKim家族基因在斑馬魚(yú)各個(gè)組織器官中的表達(dá)情況及zKim-1蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)及功能分析 目的分析KIM家族基因及zKim-1剪接變體(長(zhǎng)鏈zKim-1,短鏈zKim-1,免疫球蛋白zKim-1),在斑馬魚(yú)各個(gè)組織器官中的分布情況。依據(jù),在腎臟損傷后,KIM-1在近曲腎小管上皮細(xì)胞顯著表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制,探討zKim-1是否具有與人類(lèi)KIM-1蛋白相似的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制。體外實(shí)驗(yàn),分析zKim-1是否具有與人類(lèi)KIM-1蛋白相似的吞噬調(diào)亡細(xì)胞殘骸及氧化脂質(zhì)體的清理功能。 方法通過(guò),實(shí)時(shí)定量PCR分析Kim家族系列基因及zKim-1剪接變體(長(zhǎng)鏈zKim-1,短鏈zKim-1,免疫球蛋白zKim-1),在斑馬魚(yú)各個(gè)組織器官中的分布情況。依據(jù)zKim-1在腎臟損傷后在近曲腎小管上皮細(xì)胞顯著表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制,采用實(shí)時(shí)定量PCR,免疫熒光染色及免疫組化分析在慶大霉素導(dǎo)致急性腎臟損傷斑馬魚(yú)模型中zKim-1及其剪接變體表達(dá)調(diào)節(jié)情況。體外,與調(diào)亡細(xì)胞殘骸及氧化脂質(zhì)體共同培養(yǎng),分析zKim-1表達(dá)細(xì)胞是否具有與人類(lèi)KIM-1蛋白相似的吞噬功能。 結(jié)果KIM家族基因在斑馬魚(yú)中各個(gè)正常器官中只有較少量表達(dá),其中zKim-1在斑馬魚(yú)的鰭表達(dá)稍多,sKim-3在肌肉中表達(dá)稍多。zKim-1在損傷后的腎小管表達(dá)明顯增加,而zKim-3, zKim-4的表達(dá)無(wú)明顯變化,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。zKim-1具有對(duì)凋亡細(xì)胞及氧化脂質(zhì)體的內(nèi)吞作用。 結(jié)論1.在健康正常組織中,KIM家族基因表達(dá)微量或檢測(cè)不到。2.zKim-1具有與人類(lèi)KIM-1蛋白相似的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制,即在腎臟損傷后,zKim-1顯著表達(dá)于近曲腎小球上皮細(xì)胞。3.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),zKim-1具有與人類(lèi)KIM-1蛋白相似的吞噬凋亡細(xì)胞殘?bào)w及氧化脂質(zhì)體的清理功能。 第三章Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型構(gòu)建及表型分析 目的構(gòu)建腎小管上皮細(xì)胞特異性表達(dá)Kim-1蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú),探討Kim-1表達(dá)對(duì)斑馬魚(yú)幼苗的前腎單位及斑馬魚(yú)成魚(yú)的中腎單位的影響。 方法首先,體外構(gòu)建腎小管上皮細(xì)胞特異性表達(dá)zKim-1質(zhì)粒載體。通過(guò),分子克隆構(gòu)建zKim-1與紅色熒光融合蛋白線(xiàn)性基因片段。通過(guò),特異性酶切位點(diǎn),分子亞克隆將zKim-1耦合紅色熒光蛋白基因(sKim-1-RFP)植入腎小管上皮細(xì)胞特異性表達(dá)載體質(zhì)粒。我們采用在腎小管上皮細(xì)胞特異性表達(dá)的鈣粘蛋白17(Cadherin17, cdh17)的啟動(dòng)子,介導(dǎo)zKim-1耦合紅色熒光蛋白在斑馬魚(yú)幼苗的前腎單位及斑馬魚(yú)成魚(yú)的中腎單位中表達(dá)。通過(guò)顯微鏡下納米注射方法,將腎小管上皮細(xì)胞特異性表達(dá)zKim-1載體質(zhì)粒導(dǎo)入斑馬魚(yú)的單細(xì)胞階段的胚胎組織,并在熒光顯微鏡下實(shí)時(shí)觀(guān)察zKim-1耦合紅色熒光蛋白的表達(dá)情況。對(duì)照組,分子克隆構(gòu)建鈣粘蛋白17介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞特異性表達(dá)紅色熒光蛋白,且無(wú)zKim-1整合基因序列的表達(dá)載體。同樣,采用通過(guò)顯微鏡下納米注射方法構(gòu)建對(duì)照組斑馬魚(yú)模型。免疫印跡試驗(yàn)鑒別并驗(yàn)證Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型,并檢測(cè)Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型的各項(xiàng)生理病理指標(biāo),包括斑馬魚(yú)幼苗的活動(dòng)反映情況,心包積液及全身水腫表現(xiàn)。檢測(cè)右旋糖酐在Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型及對(duì)照組中腎小球?yàn)V過(guò)情況,反映斑馬魚(yú)幼苗的腎功能情況。通過(guò),蘇木素伊紅染色檢測(cè)Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型及對(duì)照組的腎臟病理改變。免疫熒光染色檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況及其與zKim-1的相互關(guān)系。電子顯微鏡下進(jìn)一步分析Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型及對(duì)照組腎臟微觀(guān)病理改變。 結(jié)果與對(duì)照組比較,Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型組出現(xiàn)明顯的活動(dòng)反映減弱。Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)出現(xiàn)明顯的心包積液及全身水腫,其嚴(yán)重程度與zKim-1在腎臟組織中的表達(dá)明顯正相關(guān)。Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的腎功能出現(xiàn)顯著下降,其右旋糖酐在腎小球的濾過(guò)情況明顯延遲。Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的存活比例明顯低于對(duì)照組,并與zKim-1在腎臟組織中的表況密切相關(guān)。腎臟病理方面,Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的腎小管形態(tài)不規(guī)則,管腔消失,可見(jiàn)部分腎小管上皮細(xì)胞脫落,水腫及空泡化。免疫熒光染色顯示,在Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型中,表達(dá)zKim-1的腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)活化caspase3表達(dá)陽(yáng)性。電子顯微鏡結(jié)果顯示,Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落,胞漿中可見(jiàn)大量吞噬小體并伴有部分細(xì)胞核固縮。 結(jié)論1.首次成功構(gòu)建Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型,可成為潛在的生物藥學(xué)的研究工具,為人類(lèi)急性慢性腎臟疾病的治療提供新的靶點(diǎn)。2.Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)出現(xiàn)多種近期及遠(yuǎn)期腎臟損傷表現(xiàn),其對(duì)研究Kim-1在腎臟疾病中的急性慢性腎臟損傷的發(fā)生發(fā)展研究具有重要意義。3.腎小管上皮細(xì)胞特異性表達(dá)Kim-1誘導(dǎo)腎臟損傷,可能與Kim-1受體介導(dǎo)吞噬腎小管管腔中的一些潛在毒性或非毒性的蛋白質(zhì),導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激損傷。 第四章條件性Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型構(gòu)建及持續(xù)性Kim-1表達(dá)在腎臟損傷中的病理生理作用 目的構(gòu)建腎小管上皮細(xì)胞條件性表達(dá)Kim-1蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú),探討Kim-1表達(dá)對(duì)斑馬魚(yú)幼苗的前腎單位及斑馬魚(yú)成魚(yú)的中腎單位的影響。 方法通過(guò)Cre/Loxp位點(diǎn)重組酶原理構(gòu)建轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)。首先,體外構(gòu)建構(gòu)建表達(dá)的zKim-1與紅色熒光融合蛋白線(xiàn)性基因片段。分子克隆構(gòu)建zKim-1與紅色熒光融合蛋白線(xiàn)性基因片段,特異性酶切位點(diǎn),將zKim-1耦合紅色熒光蛋白基因植入泛素(ubiquitin, ubi)啟動(dòng)的依賴(lài)Cre重組酶活性介導(dǎo)的加強(qiáng)綠色熒光蛋白與zKim-1耦合紅色熒光蛋白替換的表達(dá)載體質(zhì)粒。其次,體外構(gòu)建構(gòu)建腎小管上皮細(xì)胞特異性表達(dá)Cre的載體質(zhì)粒。分子克隆構(gòu)建Cre的線(xiàn)性基因片段,植入腎小管上皮細(xì)胞特異性表達(dá)的鈣粘蛋白17(Cadherinl7, cdh17)作為啟動(dòng)子的表達(dá)載體質(zhì)粒。通過(guò)顯微鏡下納米注射方法,將表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入斑馬魚(yú)的單細(xì)胞階段的胚胎組織,三個(gè)月后獲得鈣粘蛋白17介導(dǎo)的Cre轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)(cdh17:Cre)及啟動(dòng)的依賴(lài)Cre重組酶活性介導(dǎo)的加強(qiáng)綠色熒光蛋白與zKim-1耦合紅色熒光蛋白替換的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)(ubi:Loxp-EGFP-Loxp-zKim-1-RFP)。cdhl7:Cre轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)與ubi:Loxp-EGFP-Loxp-zKim-1-RFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)雜交后獲得腎小管上皮細(xì)胞可調(diào)節(jié)性表達(dá)的Kim-1蛋白的雙基因雜交斑馬魚(yú)。監(jiān)測(cè)Kim-1可調(diào)節(jié)性雙基因雜交斑馬魚(yú)的各項(xiàng)生理病理指標(biāo),包括斑馬魚(yú)幼苗的活動(dòng)反映情況,心包積液及全身水腫表現(xiàn)。通過(guò),蘇木素伊紅染色檢測(cè)Kim-1可調(diào)節(jié)性雙基因雜交斑馬魚(yú)的腎臟病理改變。免疫熒光染色檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況及其與zKim-1的相互關(guān)系。電子顯微鏡下進(jìn)一步分析Kim-1可調(diào)節(jié)性雙基因雜交斑馬魚(yú)的腎臟病理改變。 結(jié)果與對(duì)照組比較,Kim-1可調(diào)節(jié)性雙基因雜交斑馬魚(yú)同樣出現(xiàn)明顯的活動(dòng)反映減弱,其心包積液及全身水腫的嚴(yán)重程度與zKim-1在腎臟組織中表達(dá)成顯著正相關(guān)。Kim-1可調(diào)節(jié)性雙基因雜交斑馬魚(yú)的存活比例明顯低于對(duì)照組,與zKim-1在腎臟組織中表達(dá)程度有關(guān)。腎臟病理方面,Kim-1可調(diào)節(jié)性雙基因雜交斑馬魚(yú)同樣出現(xiàn)的腎小管形態(tài)不規(guī)則,管腔消失,可見(jiàn)部分腎小管上皮細(xì)胞脫落,水腫及空泡化。免疫熒光染色顯示,在Kim-1可調(diào)節(jié)性雙基因雜交斑馬魚(yú)模型中,表達(dá)zKim-1的腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶缺口末端標(biāo)記(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL)陽(yáng)性。電子顯微鏡結(jié)果同樣顯示,腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落,胞漿中可見(jiàn)大量吞噬小體并伴有部分細(xì)胞核固縮。 結(jié)論1.首次成功構(gòu)建可調(diào)節(jié)性Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型,排除Kim-1表達(dá)對(duì)斑馬魚(yú)前腎單位發(fā)育的影響因素,觀(guān)察Kim-1表達(dá)對(duì)腎小管上皮細(xì)胞損傷的直接影響。2.可調(diào)節(jié)性Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)可作為潛在的動(dòng)物模型,應(yīng)用于研究Kim-1在不同疾病背景下的病理生理作用,如糖尿病及慢性蛋白尿等。3.近一步證實(shí)腎小管上皮細(xì)胞損傷與特異性表達(dá)Kim-1有關(guān),可調(diào)節(jié)性Kim-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)可作為藥物篩選模型,應(yīng)用于臨床靶向治療。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R692.31

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本文編號(hào)：2280262