【摘要】：研究背景： 腎細(xì)胞癌是成人腎臟腫瘤中最常見(jiàn)的一種類(lèi)型，進(jìn)展期腎癌預(yù)后相對(duì)較差，傳統(tǒng)的治療方式如化療、放療都不敏感，細(xì)胞因子治療客觀反應(yīng)率僅為15%，僅對(duì)部分患者有效。近年來(lái)，DNA疫苗作為一種新的免疫治療方式在惡性腫瘤治療領(lǐng)域進(jìn)行了廣泛研究。本課題基于自主研發(fā)的可復(fù)制型DNA疫苗載體系統(tǒng)，成功構(gòu)建了新型可復(fù)制型雙質(zhì)�？鼓I癌DNA疫苗，兼具抗腎癌與抗血管雙重功效，希望能夠?yàn)槟I癌的免疫治療提供一種新的思路。 研究目的： 本課題的目的是對(duì)新型可復(fù)制型雙質(zhì)�？鼓I癌DNA疫苗進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)，分析其可能的免疫機(jī)制，并為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)雙質(zhì)粒疫苗的抑瘤活性，建立同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)人G250抗原及熒光素酶報(bào)告基因的小鼠腎癌單克隆細(xì)胞系。 研究方法： 1. Renca-hG250/Luc單克隆細(xì)胞系的建立：將鑒定正確的pIRES-Luc-hyg質(zhì)粒利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Renca／hG250細(xì)胞系，之后利用潮霉素加壓篩選和有限稀釋法最終獲得同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)人G250基因及熒光素酶報(bào)告基因Luc的小鼠腎癌單克隆細(xì)胞系Renca-hG250/Luc，并通過(guò)Western blot、流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞體外活體成像檢測(cè)hG250和Luc的表達(dá)情況。 2.雙質(zhì)粒疫苗動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究：雙質(zhì)�？鼓I癌疫苗pSVK-tG250+CAVE及其他對(duì)照疫苗通過(guò)肌肉注射＋電穿孔的方式免疫Balb/c小鼠，間隔1周共免3次，并在末次免疫后1周皮下接種2×105個(gè)Renca-hG250/Luc細(xì)胞，建立荷瘤小鼠模型。首先觀察腫瘤生長(zhǎng)情況及荷瘤小鼠生存時(shí)間，評(píng)價(jià)抑瘤效果；其次研究雙質(zhì)粒疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫學(xué)機(jī)制：收集免疫后小鼠血清，檢測(cè)hG250和mVEGFR2特異性IgG抗體水平，以及hG250特異性IgG1/IgG2的比值；處死小鼠并分離脾臟淋巴細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞的特異性增值活性，ELISPOT檢測(cè)hG250及mVEGFR2特異性脾臟淋巴細(xì)胞IFN-γ分泌，ELISA法檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞Th1類(lèi)細(xì)胞因子（IL-2和INF-γ）的分泌，最后LDH法檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞CTL殺傷活性。 結(jié)果： 1.成功建立了同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)hG250和熒光素酶報(bào)告基因的小鼠腎癌單克隆細(xì)胞系Renca-hG250/Luc，其hG250和luc的陽(yáng)性表達(dá)率分別達(dá)到81.87%和81.03%，能夠有效地與熒光素酶底物發(fā)生反應(yīng)放出熒光。 2.雙質(zhì)粒疫苗pSVK-tG250+CAVE免疫小鼠后，發(fā)現(xiàn)與PBS組、pSVK空載體及pSVK-tG250、CAVE單獨(dú)應(yīng)用組相比，成瘤時(shí)間最多延長(zhǎng)10天（P＜0.05），小鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，小鼠的平均生存期延長(zhǎng)；雙質(zhì)粒疫苗在肌肉注射加電穿孔免疫方式下能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的hG250和mVEGFR2特異性抗體，并且小鼠血清中抗hG250IgG1/IgG2a的比值為0.76，低于其他各組；在hG250和mVEGFR2抗原的刺激下，雙質(zhì)粒疫苗組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞特異性IFN-γ分泌數(shù)分別達(dá)到405±52個(gè)/5×105和453±61個(gè)/5×105脾臟淋巴細(xì)胞；此外，雙質(zhì)粒組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞具有更高的增值活性，，hG250抗原刺激后脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中可檢測(cè)到Th1類(lèi)細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ大量釋放；最后，雙質(zhì)粒疫苗組對(duì)腎癌靶細(xì)胞的CTL殺傷活性得到了明顯增強(qiáng)，在效靶比為40:1、20:1和10:1時(shí)分別達(dá)到51.12%、39.23%和25.88%。 結(jié)論： 新型可復(fù)制型抗腎癌雙質(zhì)粒疫苗能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生高效的抗腎癌體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有抗腎癌和抗血管雙重功效，有效地抑制腎癌的生長(zhǎng)，為腎癌的免疫治療提供了新的方法。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.11

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本文編號(hào)：2269866