【摘要】：目的糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)作為糖尿病(diabetes mellitus,DM)常見微血管并發(fā)癥,是導(dǎo)致終末期腎臟病(ESRD)的主要原因之一。在過去幾十年,DN發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年遞增的趨勢(shì),已成為糖尿病患者致殘、致死的主要原因之一。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,近來(lái)研究已證實(shí)炎性反應(yīng)在DN發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不可小覷的作用。多種炎癥信號(hào)通路介導(dǎo)DN發(fā)生發(fā)展,其中TLR4及其下游NF-κB信號(hào)通路參與包括炎性反應(yīng)、固有免疫等多種生物效應(yīng)過程。高糖、糖基化終末產(chǎn)物等刺激可以激活TLR4,繼而進(jìn)一步激活下游NF-κB等炎癥通路,誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá),最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。因此抑制炎癥信號(hào)通路可延緩DN進(jìn)展。miRNA是的從穩(wěn)定發(fā)夾狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)通過一系列酶切而來(lái)的長(zhǎng)度約21-25個(gè)核苷酸,屬于高度保守的非編碼單鏈小RNA分子。它具有重要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的功能,參與了真核生物的一系列病理生理過程。近年來(lái)研究表明miRNA與DN的發(fā)生發(fā)展之間存在密切的聯(lián)系,并且可以通過抑制炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)改善DN的進(jìn)展,但其具體機(jī)制不詳。雷公藤甲素是從雷公藤中提取出來(lái)的主要的活性成分,具有抗炎、抗免疫的作用。雷公藤甲素的抗炎、抗免疫作用主要是通過作用于T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞,和抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)、黏附和趨化因子分泌來(lái)實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)雷公藤甲素能夠有效降低蛋白尿,改善足細(xì)胞足突融合,減輕腎小球肥大從而改善DN腎臟損傷。但是雷公藤甲素對(duì)于糖尿病腎小管間質(zhì)病變作用及其機(jī)制的研究相對(duì)較少。最近一些研究表明雷公藤甲素可以通過調(diào)控miRNA發(fā)揮藥理作用。雷公藤甲素和miRNA在DN炎癥反應(yīng)之間是否存在關(guān)聯(lián),是我們需要探討的問題。本實(shí)驗(yàn)旨在研究雷公藤甲素是否可以通過miRNA減輕DN的炎癥反應(yīng)從而延緩DN進(jìn)展。方法大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E細(xì)胞株)置于含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中,于5%CO2,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2-3天更換培養(yǎng)液,培養(yǎng)至80%融合,以0.25%胰蛋白酶消化,傳代或用于實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NRK-52E細(xì)胞,以1×105/ml密度接種于6孔無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每次干預(yù)前將各組培養(yǎng)基換為無(wú)血清含0.2%BSA的低糖培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓,以保證細(xì)胞同步化。(1)將NRK-52E細(xì)胞分為NG組(DMEM低糖培養(yǎng)基,含葡萄糖5.5mmol/L)、MA組(DMEM低糖培養(yǎng)基,含甘露醇19.5 mmol/L)、HG組(DMEM高糖培養(yǎng)基,含葡萄糖25mmol/L)、HG+TP組(HG+雷公藤甲素5ng/ml),各組細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,采用qRT-PCR及Western-blot分別從基因水平、蛋白水平檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞中炎癥因子TLR4、NF-κB、TGF-β1、ICAM-1的表達(dá);用miRNA芯片篩查三組之間有差異性表達(dá)的miRNA并用qRT-PCR來(lái)驗(yàn)證。(2)向高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-224-3p mimics及mimics NC分為NG組、HG組、HG+miR-NC組(HG+mimics NC)、HG+miR-224-3pm組(HG+miR-224-3p mimics),轉(zhuǎn)染48h收集細(xì)胞,qRT-PCR及Western-blot檢測(cè)TLR4、NF-κB、TGF-β1、ICAM-1 m RNA和蛋白的表達(dá)。(3)向293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染重組構(gòu)建的含TLR4 m RNA 3'UTR區(qū)的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和miR-224-3p mimics,應(yīng)用雙熒光素酶活性檢測(cè)驗(yàn)證TLR4 m RNA的3'UTR與miR-224-3p有無(wú)直接結(jié)合。(4)向雷公藤甲素干預(yù)的高糖培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-224-3p的inhibitor及inhibitor NC,分為NG組、HG組、HG+TP組、HG+TP+miR-i NC組(HG+雷公藤甲素+inhibitor NC)、HG+TP+miR-224-3pi組(HG+雷公藤甲素+miR-224-3p inhibitor)轉(zhuǎn)染24h后加入雷公藤甲素,轉(zhuǎn)染后共培養(yǎng)48h收集細(xì)胞,qRT-PCR及Western-blot檢測(cè)TLR4、NF-κB、TGF-β1、ICAM-1m RNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果(1)NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)24h后,qRT-PCR及Western-blot結(jié)果顯示與NG組比較HG組TLR4、NF-κB、TGF-β1和ICAM-1m RNA及蛋白表達(dá)均顯著增加(P0.05),與HG組比較HG+TP組TLR4、NF-κB、TGF-β1和ICAM-1m RNA及蛋白表達(dá)均顯著減少(P0.05)。miRNA芯片分析提示miR-224-3p在高糖組表達(dá)明顯下調(diào)(P0.05),而在HG+TP組明顯上調(diào)(P0.05)。隨后我們?cè)黾訕颖玖坷胵RT-PCR驗(yàn)證每組mir-224-3p表達(dá)差異。結(jié)果與miRNA芯片分析一致。(2)向高糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-224-3p mimics后培養(yǎng)48h,RT-PCR及Western-blot結(jié)果顯示與NG組相比HG組TLR4、NF-κB、TGF-β1和ICAM-1m RNA及蛋白表達(dá)均顯著增加(P0.05),與HG組相比HG+miR-224-3pm組TLR4、NF-κB、TGF-β1和ICAM-1m RNA及蛋白表達(dá)顯著降低(P0.05)。(3)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示:miR-224-3p能夠顯著的抑制TLR4 3'-非編碼(3'-UTR)區(qū)熒光素酶活性(P0.01),但是對(duì)突變的TLR4-3’UTR熒光素酶活性沒有影響。(4)向HG+TP組細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-224-3p inhibitor,RT-PCR及Western-Blotting結(jié)果顯示與HG組相比HG+TP組TLR4、NF-κB、TGF-β1和ICAM-1m RNA及蛋白表達(dá)顯著降低(P0.05),與HG+TP相比HG+TP+miR-224-3pi組TLR4、NF-κB、TGF-β1和ICAM-1m RNA表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05)。結(jié)論(1)雷公藤甲素降低腎小管上皮細(xì)胞TLR4、NF-κB、TGF-β1和ICAM-1表達(dá),減輕高糖誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。(2)miR-224-3p能與TLR4 3'UTR區(qū)結(jié)合抑制TLR4表達(dá)。雷公藤甲素通過上調(diào)miR-224-3p的表達(dá)抑制TLR4表達(dá)改善高糖誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞的炎癥反應(yīng),而下調(diào)miR-224-3p的表達(dá)能夠減弱雷公藤甲素的抗炎作用。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2267032