發(fā)布時間：2018-09-19 08:54

【摘要】：目的通過觀察早期糖尿病腎臟疾病(Diabetic kidney disease,DKD)患者尿白蛋白排泄(Urinary albumin excretion,UAE)、尿液中丙二醛(Malonaldehyde,MDA)含量、晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced oxidation protein products,AOPPs)含量、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性,和二甲雙胍(Metformin)治療后上述指標的的變化,以及尿液MDA和AOPPs含量、SOD和CAT活性的變化與尿白蛋白排泄的變化之間的關(guān)系,探討二甲雙胍對糖尿病腎臟疾病的保護作用及機制。方法:選擇2012年01月—2013年12月于我院體檢中心健康成人54例及門診和住院的2型糖尿病(WHO標準,1999)同時伴有早期DKD(診斷標準UAER 20~200ug/min)的患者120例,隨機分組如下:①正常對照組:健康志愿者②二甲雙胍組(MET):二甲雙胍干預(yù);③阿卡波糖組(ACA):阿卡波糖干預(yù);二甲雙胍組與阿卡波糖組均予糖尿病健康教育、合理飲食及適量運動干預(yù),分別于治療前及治療后第1、3、6個月收集患者尿液及血液。觀察二甲雙胍組與阿卡波糖組患者治療前后體重指數(shù)(BMI)變化,水銀血壓計測量收縮壓(Systolic blood pressure,SBP)及舒張壓(Diastolic blood pressure,DBP),全自動生化分析儀檢測空腹血糖(Fasting plasma glucose,FPG)、餐后2h血糖(2h-Postprandial plasma glucose,2hPG)、血低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、甘油三酯(Triglyceride,TG),采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測尿MDA(UMDA)與AOPPs(UAOPPs)含量、尿SOD(USOD)與CAT(UCAT)活性、高效液相色譜法測定糖化血紅蛋白(hba1c)、免疫比濁法檢測尿白蛋白、肌氨酸氧化酶法檢測尿肌酐(ucr)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定空腹血胰島素(fastingseruminsulin,fins)。采用葡萄糖自身穩(wěn)定數(shù)學(xué)模型評價法計算胰島素抵抗指數(shù)(homa公式:iri=fbg×fins/22.5)。結(jié)果1.各組fpg、2hpg、hba1c、bmi、fins、iri的比較與正常對照組相比,治療前二甲雙胍組與阿卡波糖組患者fpg、2hpg和hba1c均有明顯升高(p0.05)。較治療前相比,治療后第1個月兩組患者fpg、2hpg均有明顯下降(p0.05),hba1c無明顯下降(p0.05)。治療后第3、6個月兩組患者fpg、2hpg和hba1c均有明顯下降(p0.05),但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。較治療前相比,二甲雙胍組治療后第1、3、6個月bmi、fins、iri明顯下降(p0.05),而阿卡波糖組治療后bmi、fins無明顯下降(p0.05),iri明顯下降(p0.05),兩組間差異明顯(p0.05)。2.各組tg、ldl-c、sbp、dbp的比較與正常對照組相比,治療前二甲雙胍組與阿卡波糖組患者tg、ldl-c、sbp和dbp均有明顯升高(p0.05)。較治療前相比,二甲雙胍組與阿卡波糖組患者治療后第1、3、6個月tg、ldl-c、sbp、dbp均無明顯下降(p0.05)。3.各組患者umda/ucr、uaopps/ucr,usod/ucr、ucat/ucr的比較與正常對照組相比,治療前二甲雙胍組與阿卡波糖組患者umda/ucr、uaopps/ucr升高,usod/ucr、ucat/ucr降低(p0.05)。與治療前相比,治療后第1、3、6個月二甲雙胍組患者umda/ucr、uaopps/ucr明顯降低、usod/ucr、ucat/ucr均有明顯升高(p0.05)。而阿卡波糖組治療后患者umda/ucr、uaopps/ucr,usod/ucr和ucat/ucr無明顯改變(p0.05),兩組間差異明顯(p0.05)。4.各組患者uae/ucr(uacr)的比較與正常對照組相比,治療前二甲雙胍組與阿卡波糖組患者uacr均有升高(p0.05)。與治療前相比,治療后第1、3、6個月二甲雙胍組患者uacr下降(p0.05),阿卡波糖組治療后患者UACR無明顯下降(P0.05),兩組間差異明顯(P0.05)。5.UACR和UMDA/UCr相關(guān)性分析二甲雙胍組治療前后UACR和UMDA/UCr呈正相關(guān)(r=0.834,P0.05)6.UACR和UAOPPs/UCr相關(guān)性分析二甲雙胍組治療前后UACR和UAOPPs/UCr呈正相關(guān)(r=0.821,P0.05)7.UACR和USOD/UCr相關(guān)性分析二甲雙胍組治療前后UACR和USOD/UCr呈負相關(guān)(r=-0.867,P0.05)8.UACR和UCAT/UCr相關(guān)性分析二甲雙胍組治療前后UACR和UCAT/UCr呈負相關(guān)(r=-0.877,P0.05)結(jié)論2型糖尿病患者尿液中MDA、AOPPs和尿白蛋白排泄增加,SOD、CAT活性減低;二甲雙胍可減少尿MDA、AOPPs和白蛋白排泄,并升高SOD、CAT活性,上述作用可能是其腎臟保護的部分機制。目的通過觀察體外高濃度葡萄糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞(Mesangial cells,MCs)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生、P22phoxm RNA及蛋白表達、絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)蛋白磷酸化表達和細胞培養(yǎng)上清液中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced oxidation protein products,AOPP)含量、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性,以及二甲雙胍(Metformin,MET)干預(yù)后的效應(yīng),探討二甲雙胍對MCs氧化應(yīng)激的影響及機制。方法體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞,隨機分組如下:①NC組(正常對照組):低糖DMEM培養(yǎng)液(葡萄糖濃度為5.6 mmol/L);②HG組(高濃度葡萄糖培養(yǎng)組):高糖DMEM培養(yǎng)液(葡萄糖濃度為30mmol/L);③MET組(二甲雙胍干預(yù)組):高糖DMEM培養(yǎng)液(葡萄糖濃度為30mmol/L)加入二甲雙胍(5mmol/L)干預(yù);④SB組(SB203580干預(yù)組,SB203580-p38MAPK抑制劑):高糖DMEM培養(yǎng)液(葡萄糖濃度為30mmol/L)加入SB203580(10umol/L)干預(yù);⑤NAC組(N-乙酰-L-半胱氨酸干預(yù)組,NAC-抗氧化劑):高糖DMEM培養(yǎng)液(葡萄糖濃度為30mmol/L)加入N-乙酰-L-半胱氨酸(100umol/L)干預(yù).以上各組培養(yǎng)48小時后收集大鼠腎小球系膜細胞及培養(yǎng)上清液。以2',7'-二氯雙氫熒光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)為熒光探針,采用流式細胞儀檢測大鼠腎小球系膜細胞內(nèi)ROS水平。以實時定量PCR法(Real-time quantitative polymerase chainreaction,QPCR)檢測大鼠腎小球系膜細胞NADPH氧化酶跨膜亞基P22phoxm RNA表達,采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清液中丙二醛(MDA)、晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性。Western blot法檢測P22phox蛋白表達及p38MAPK蛋白磷酸化表達。結(jié)果1.各組大鼠腎小球系膜細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的比較1.1高濃度葡萄糖培養(yǎng)對大鼠腎小球系膜細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響與NC組(0.7±0.2)相比,高濃度葡萄糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞48h后,細胞內(nèi)ROS水平明顯增加為19.4±2.5,差異顯著(P0.05)。1.2二甲雙胍、SB203580及NAC對高濃度葡萄糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響與HG組(19.4±2.5)相比,MET組細胞內(nèi)ROS水平明顯下降至7.2±1.4;SB組細胞內(nèi)ROS水平明顯下降為12.8±1.8;NAC組細胞內(nèi)ROS水平明顯下降為4.2±0.9,差異均顯著(P0.05)。2.各組大鼠腎小球系膜細胞P22phox m RNA表達的比較2.1高濃度葡萄糖培養(yǎng)對大鼠腎小球系膜細胞P22phox m RNA表達的影響與NC組(1±0)相比,高濃度葡萄糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞48h后,細胞P22phox m RNA表達水平增加為4.5±0.7,差異顯著(P0.05)。2.2二甲雙胍、SB203580及NAC對高濃度葡萄糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞P22phox m RNA表達的影響與HG組(4.5±0.7)相比,MET組細胞P22phox m RNA的表達水平下降為3.5±0.5;SB組細胞P22phox m RNA的表達水平下降為3.6±0.5;NAC組細胞P22phox m RNA的表達水平下降為3.0±0.4,差異均顯著(P0.05)。3.各組大鼠腎小球系膜細胞P22phox蛋白表達的比較3.1高濃度葡萄糖培養(yǎng)對大鼠腎小球系膜細胞P22phox蛋白表達的影響與NC組(0.24±0.1)相比,高濃度葡萄糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞48h后,細胞P22phox蛋白表達水平增加為0.64±0.2,差異顯著(P0.05)。3.2二甲雙胍、SB203580及NAC對高濃度葡萄糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞P22phox蛋白表達的影響與HG組(0.64±0.2)相比,MET組細胞P22phox蛋白的表達水平下降為0.36±0.1;SB組細胞P22phox蛋白的表達水平下降為0.46±0.1;NAC組細胞P22phox蛋白的表達水平下降為0.33±0.1,差異均顯著(P0.05)。4.各組大鼠腎小球系膜細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達的比較4.1高濃度葡萄糖培養(yǎng)對大鼠腎小球系膜細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達的影響與NC組(0.14±0.04)相比,高濃度葡萄糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞48h后,細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達水平增加為0.54±0.2,差異顯著(P0.05)。4.2二甲雙胍、SB203580及NAC對高濃度葡萄糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達的影響與HG組(0.54±0.2)相比,MET組細胞p38MAPK蛋白磷酸化的表達水平下降為0.39±0.1;SB組細胞p38MAPK蛋白磷酸化的表達水平下降為0.26±0.1;NAC組細胞p38MAPK蛋白磷酸化的表達水平下降為0.43±0.1,差異均顯著(P0.05)。5.各組大鼠腎小球系膜細胞上清液中丙二醛(MDA)、晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)含量的比較5.1高濃度葡萄糖培養(yǎng)對大鼠腎小球系膜細胞上清液中MDA、AOPPs產(chǎn)生的影響與NC組(627.2±62.9)相比,高濃度葡萄糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞48h后,細胞上清液中MDA含量增加為846.8±87.2,差異顯著(P0.05)。與NC組(557.6±94.7)相比,高濃度葡萄糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞48h后,細胞上清液中AOPPs含量明顯增加為851.4±127.3,差異顯著(P0.05)。5.2二甲雙胍、SB203580及NAC對高濃度葡萄糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞上清液中MDA、AOPP含量的影響與HG組(846.8±87.2)相比,MET組細胞上清液中MDA含量下降為733.2±71.3;SB組細胞上清液中MDA含量下降為770.4±76.0;NAC組細胞上清液中MDA含量下降為720.2±69.1,差異均顯著(P0.05)。與HG組(851.4±127.3)相比,MET組細胞上清液中AOPP含量下降為649.8±109.8;SB組細胞上清液中AOPP含量下降為695.6±112.9;NAC組細胞上清液中AOPP含量下降為598.6±103.4,差異均顯著(P0.05)。6.各組大鼠腎小球系膜細胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性的比較6.1高濃度葡萄糖培養(yǎng)對大鼠腎小球系膜細胞上清液中SOD、CAT活性的影響與NC組(171.8±42.6)相比,高濃度葡萄糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞48h后,細胞上清液中SOD活性下降為130.2±28.4,差異顯著(P0.05)。與NC組(34.4±8.1)相比,高濃度葡萄糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞48h后,細胞上清液中CAT活性下降為14.0±3.5,差異顯著(P0.05)。6.2二甲雙胍、SB203580及NAC對高濃度葡萄糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞上清液中SOD、CAT活性的影響與HG組(130.2±28.4)相比,MET組細胞上清液中SOD活性增加為145.4±33.5;SB組細胞上清液中SOD活性增加為149.4±34.3;NAC組細胞上清液中SOD活性增加為151.6±36.5,差異均顯著(P0.05)。與HG組(14.0±3.5)相比,MET組細胞上清液中CAT活性增加為25.4±5.8;SB組細胞上清液中CAT活性增加為21.0±5.1;NAC組細胞上清液中CAT活性增加為26.6±6.3,差異均顯著(P0.05)。7.腎小球系膜細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達變化和細胞內(nèi)ROS水平變化相關(guān)性分析二甲雙胍治療前后大鼠腎小球系膜細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達變化和細胞內(nèi)ROS水平變化呈正相關(guān)(r=0.770,P0.05)。8.腎小球系膜細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達變化和上清液中MDA含量變化相關(guān)性分析二甲雙胍治療前后大鼠腎小球系膜細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達變化和上清液中MDA含量變化呈正相關(guān)(r=0.909,P0.05)。9.腎小球系膜細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達變化和上清液中AOPPS含量變化相關(guān)性分析二甲雙胍治療前后大鼠腎小球系膜細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達變化和上清液中AOPPs含量變化呈正相關(guān)(r=0.941,P0.05)。10.腎小球系膜細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達變化和上清液中SOD活性變化相關(guān)性分析二甲雙胍治療前后大鼠腎小球系膜細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達變化和上清液中SOD活性變化呈負相關(guān)(r=-0.882,P0.05)。11.腎小球系膜細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達變化和上清液中CAT活性變化相關(guān)性分析二甲雙胍治療前后大鼠腎小球系膜細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達變化和上清液中CAT活性變化呈負相關(guān)(r=-0.890,P0.05)。12.腎小球系膜細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達變化和P22phox蛋白表達變化相關(guān)性分析二甲雙胍治療前后大鼠腎小球系膜細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達變化和P22phox蛋白表達變化呈正相關(guān)(r=0.858,P0.05)。13.腎小球系膜細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達變化和P22phox m RNA表達變化相關(guān)性分析二甲雙胍治療前后大鼠腎小球系膜細胞p38MAPK蛋白磷酸化表達變化和P22phox m RNA表達變化呈正相關(guān)(r=0.875,P0.05)。結(jié)論(1)高濃度葡萄糖誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多、P22phox m RNA及蛋白表達、p38MAPK蛋白磷酸化表達增加、細胞培養(yǎng)上清液中丙二醛、晚期氧化蛋白產(chǎn)物含量增多,超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性減低(2)二甲雙胍可抑制高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細胞內(nèi)氧化應(yīng)激,其機制可能部分與其抑制P22phoxm RNA及蛋白過表達和p38MAPK蛋白磷酸化有關(guān),該作用可能是其腎臟保護的機制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R587.2;R692.9

【參考文獻】

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1 魏倩萍;鄧華聰;趙R，

本文編號：2249653