【摘要】：背景勃起功能障礙(erectile dysfunction, ED)是中老年男性最常見的性功能障礙之一,是一個令人困擾的問題,且隨著現(xiàn)在生活節(jié)奏和壓力增大等因素的改變,ED的發(fā)病率逐年升高。ED被認為是一個良性疾病,但它與密切關系著人們的身心健康,而且對患者及其家人的生活質(zhì)量均產(chǎn)生重大影響。據(jù)報道,約有52%的40-70歲男性患有ED,到2025年,預計全球大約有3.22億男性存在不同程度的勃起功能障礙。最新流行病學研究發(fā)現(xiàn),ED的發(fā)病率在小于40歲男性患者中為1%-10%,40-49歲為2%-9%、60-69歲為20%-40%,而在大于70歲的男人中則高達50-100%。雖然目前ED的治療方法較多,但存在缺陷,比如療程過長、療效不確切、費用高昂、尤其是很大一部分ED患者對一線藥物5型磷酸二酯酶抑制劑效果不明顯而又不能或不愿意接受二線治療(如真空勃起裝置)和三線治療(陰莖假體置入)方案等。因此,探索更理想合理的治療方案是ED臨床治療的迫切需求。ED的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多環(huán)節(jié)的復雜過程,其具體發(fā)病機制目前尚不十分明確。因而,明確ED的發(fā)病機理對尋找有效的預防和治療措施具有重要的意義。陰莖海綿體由網(wǎng)格狀海綿體小梁和小梁間隙所構(gòu)成。海綿體小梁是由大量平滑肌細胞組成的,陰莖海綿體平滑肌細胞(corpus cavernosum smooth muscle cell, CCSMC)是陰莖海綿體主要的收縮與松弛組成成分,陰莖海綿體平滑肌為陰莖勃起過程中的終末組織,處于重要的核心地位。CCSMC是陰莖海綿體收縮與舒張的主要成分,在陰莖勃起的過程中發(fā)揮著至關重要的作用,它既是陰莖能夠維持正常勃起的結(jié)構(gòu)基礎,也是神經(jīng)、血管、內(nèi)分泌等諸多因素作用的終末組織。所以當CCSMC的數(shù)量或者功能發(fā)生變化時,必將對陰莖的正常勃起產(chǎn)生重大的影響。有學者研究表明,糖尿病引起的CCSMC數(shù)量減少、細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變及細胞舒縮功能受損是導致ED發(fā)生的重要原因。我們也已證實糖尿病性ED大鼠的陰莖海綿體組織及細胞中,CCSM細胞數(shù)量減少及細胞舒縮功能受損；進一步研究發(fā)現(xiàn)平滑肌細胞(SMC, smooth muscle cells)標記物、收縮相關因子α肌動蛋白(a-smooth muscle actin, a-SMA)、平滑肌細胞肌球蛋白重鏈(smooth muscle myosin heavy chain, SMMHC)、肌滑蛋白(smoothelin)、堿性調(diào)寧蛋白(calponin)表達明顯下降。因此,ED的發(fā)生與CCSMC的病理改變和缺失密切相關,目前尚缺乏從根本上改善這些病理狀態(tài)的理想方法。研究表明,CCSMC數(shù)量的變化與ED的嚴重程度關系非常密切。糖尿病ED大鼠中CCSMC凋亡增加,細胞外基質(zhì)纖維化增加,海綿體小梁則失去了維持正常的收縮和舒張功能的基礎,流入海綿竇內(nèi)動脈血減少,致使陰莖勃起時海綿竇內(nèi)壓力不足以壓迫阻斷白膜下的靜脈網(wǎng),從而導致ED發(fā)生。細胞凋亡是在特定的內(nèi)源和外源信號誘導下,機體內(nèi)細胞的死亡程序被激活,并在相關基因的調(diào)控下發(fā)生的程序性死亡。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展和應用,我們對于細胞凋亡的過程有了更深刻的認識,但是迄今關于細胞凋亡的確切機制仍未完全闡明。細胞增殖是細胞分裂增加細胞數(shù)量的一個過程。細胞增殖是生物體重要的生命特征之一,也是機體維持細胞數(shù)量平衡和正常功能所需的必要條件。細胞的凋亡與增殖現(xiàn)象是互相聯(lián)系和密不可分的,貫穿于我們生命活動的始終,維系機體內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡。平滑肌細胞與骨骼肌細胞及心肌細胞有所不同,平滑肌細胞的分化狀態(tài)可以逆轉(zhuǎn),根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同,可以將血管平滑肌分為收縮型和合成型兩種。收縮型的主要功能是維持平滑肌的收縮和舒張,維持組織器官的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能,而合成型主要在細胞增殖、分化、遷移、分泌及降解胞外蛋白等方面發(fā)揮作用,平滑肌細胞能根據(jù)細胞的局部環(huán)境或因子的刺激而重塑其表型,具有雙向分化功能,因此,將平滑肌細胞在收縮型與合成型兩種表型之間的轉(zhuǎn)化稱之為表型轉(zhuǎn)化。動脈粥樣硬化的早期,血管平滑肌細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,細胞增殖很快,形成粥樣斑塊,而在晚期的時候,血管平滑肌細胞增殖明顯下降,胞外膠原基質(zhì)增生,出現(xiàn)平滑肌萎縮,伴有組織纖維化改變。陰莖海綿體被喻為血管的終末組織,是一種類似的血管組織,本課題組前期研究已經(jīng)證實：早期糖尿病大鼠的CCSMC增殖速度明顯快于正常對照組。經(jīng)驗證后證實CCSMC也存在收縮性和合成型兩種表型并擁有表型轉(zhuǎn)化的特性。我們也發(fā)現(xiàn)血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB)可促進CCSMC由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化。同時還發(fā)現(xiàn)糖尿病ED動物模型和高血壓ED動物模型的CCSMC也發(fā)生了表型轉(zhuǎn)化,從而推測CCSMC的表型轉(zhuǎn)化與ED之間存在密切的關系。因此,研究CCSMC發(fā)的表型轉(zhuǎn)化對了解ED的病因和治療有重要臨床意義。微小核糖核酸(microRNA, miRNA)為小分子非編碼RNA,它的基因廣泛存在于各個染色體中,這些miRNA只占人類基因總數(shù)的2%,但卻調(diào)控著人類30%以上的基因表達,在細胞中發(fā)揮極其重要的調(diào)控作用,尤其是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、器官的發(fā)育以及細胞增殖和分化方面。研究發(fā)現(xiàn),miR-145主要在血管平滑肌細胞中表達且它的表達與平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化有關,是血管平滑肌的一個重要的表型調(diào)節(jié)劑。在血管損傷和動脈硬化時,miR-145的表達呈下降趨勢,平滑肌細胞增殖分化加快；而恢復它的表達后可見到平滑肌細胞增殖被抑制,收縮和舒張功能增強,平滑肌細胞恢復了收縮型狀態(tài)。較多研究發(fā)現(xiàn)miR-145在血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化中起著重要作用,目前眾多研究表明血管平滑肌細胞和CCSMC在生理功能上類似,但目前推測miR-145是否對其表型轉(zhuǎn)化也存在調(diào)控作用尚不明確,課題組前期發(fā)現(xiàn)與正常大鼠相比,miR-145在糖尿病性ED大鼠中的表達量是明顯減低的,且糖尿病性勃起功能障礙大鼠CCSMC也發(fā)生了表型轉(zhuǎn)化,從而我們推測miR-145在CCSMC的表型轉(zhuǎn)化中可能也起著重要的作用。但miRNA-145對CCSMC有何影響?miRNA-145的缺失或過表達對大鼠勃起功能的影響和具體的調(diào)控機制是如何的?我們目前并不清楚。目的本研究首先構(gòu)建高效穩(wěn)定的沉默及過表達miR-145慢病毒載體,然后通過細胞實驗及動物實驗了解miRNA-145對CCSMC表型轉(zhuǎn)化的影響和可能的機制,為闡明勃起功能障礙的發(fā)病機制和提供治療手段提供理論依據(jù)。方法1.miR-145沉默與過表達慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定a)構(gòu)建miR-145沉默與過表達慢病毒載體b)原代培養(yǎng)大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞及鑒定c)病毒感染CCSMC后采用RT-PCR檢測感染效率2.miR-145在體外對大鼠CCSMC的表型轉(zhuǎn)化和增殖的影響1)MTS檢測miR-145對細胞增殖的影響。2)流式細胞儀檢測miR-145對細胞周期的影響。3)劃痕實驗檢測miR-145對細胞遷移能力的影響。4)反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測miR-145對細胞表型標志物的影響。5)蛋白質(zhì)印跡(Western blot, WB)檢測miR-145對細胞表型標志物的影響。3.miR-145在體內(nèi)對SD大鼠陰莖海綿體平滑肌表型轉(zhuǎn)化和勃起功能的影響1)沉默miR-145對大鼠陰莖勃起功能的影響。2)免疫組化檢測沉默miR-145對大鼠陰莖海綿體平滑肌表型標志物的表達情況3) RT-PCR檢測沉默miR-145對大鼠陰莖海綿體平滑肌表型標志物mRNA表達的影響。4)WB檢測沉默miR-145對大鼠陰莖海綿體平滑肌表型標志物蛋白表達的影響。結(jié)果1.miR-145沉默與過表達慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定1)成功構(gòu)建miR-145沉默與過表達慢病毒載體2)成功分離、原代培養(yǎng)大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞,顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的細胞形態(tài)呈平滑肌細胞特征性生長,表現(xiàn)為梭形,呈谷-峰樣生長。a-SMA免疫熒光鑒定：熒光顯微鏡下可見綠色熒光分布在胞核和胞漿中,陽性率達95%以上。3)RT-PCR結(jié)果顯示：與正常對照組比較,anti-NC組細胞中miR-145的表達量降低了8%±3%,其差異無統(tǒng)計學意義；而anti-miR-145組細胞中miR-145的表達量降低了76%±5%,其差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與正常對照組比較,miR-NC組細胞中miR-145的表達量升高1.52±0.5倍,其差異無統(tǒng)計學意義,miR-145組細胞中miR-145的表達量增加了135.5±9倍,其差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.miR-145在體外對大鼠CCSMC的表型轉(zhuǎn)化和增殖的影響1)MTS結(jié)果顯示：anti-miR-145后細胞的增殖能力較空白對照組及anti-NC組增強,其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。過表達miRNA-145后細胞的增殖能力較正常對照組和miR-NC組減弱,PDGF-BB組較正常對照組增殖能力增強,PDGF-BB+miR-145組細胞增殖能力較PDGF-BB組減弱,但較miR-145組增強,各組間差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2)流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：正常對照組Go/G1期細胞比例為90.3%±1.94%,anti-NC組G0/G1期比例為細胞89.5±2.16%,anti-miR-145組G0/G1期細胞比例為71.6%±3.28%,anti-NC組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義,anti-miR-145組與anti-NC組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。正常對照組S期細胞比例為6.2%±0.87%,anti-NC組S期細胞比例為7.3%±1.13%,anti-miR-145組S期細胞18.2%±1.16%,anti-NC組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義,anti-miR-145組與anti-NC組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。正常對照組G2/M期細胞比例為3.5%±0.75%,anti-NC組G2/M期細胞比例為3.2%±1.15%,anti-miR-145組G2/M期細胞比例為10.2%±3.15%,anti-NC組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義,anti-miR-145組與anti-NC組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3)劃痕實驗結(jié)果顯示anti-miRNA-145后細胞的遷移能力較正常對照組及anti-NC組增強。miRNA-145組細胞的遷移能力較正常對照組及miR-NC組稍減弱,PDGF-BB組較正常對照組遷移能力增強,PDGF-BB+miR-145組細胞遷移能力較PDGF-BB組減弱,但較niRNA-145組增強。4) RT-PCR結(jié)果顯示anti-miR-145組細胞α-SMA、SMMHC、Calponin的mRNA表達較anti-NC組減少,且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。anti-NC組和正常對照組間差異無統(tǒng)計學意義。miRNA-145組細胞α-SMA、SMMHC、Calponin的mRNA表達較miR-NC組增強,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。PDGF-BB組細胞α-SMA、SMMHC、Calponin的]mRNA表達較正常對照組減弱,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。PDGF-BB+miR-145組細胞α-SMA、SMMHC、Calponin的mRNA表達較PDGF-BB組增強,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。miR-NC組和正常對照組間差異無統(tǒng)計學意義。5) Western blot結(jié)果顯示anti-miR-145細胞α-SMA、Calponin的蛋白表達較正常對照組及anti-NC組減少。miRNA-145組細胞α-SMA、Calponin的蛋白表達較miR-NC組增強,PDGF-BB組細胞α-SMA、Calponin的蛋白表達較正常對照組減弱,PDGF-BB+miR-145組細胞α-SMA、Calponin的蛋白表達較PDGF-BB組增強。3.miR-145在體內(nèi)對SD大鼠陰莖海綿體平滑肌表型轉(zhuǎn)化和勃起功能的影響。1)頸動脈壓(mean arterial pressure, MAP)在假手術(shù)組(sham)、無關序列組(anti-NC)、培養(yǎng)基組(DMEM)、沉默miRNA-145組(anti-miR-145)間總體比較差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 anti-miR-145組與Sham組、anti-NC組、DMEM組比較陰莖海綿體內(nèi)壓(Intracavernous pressure, ICP)減弱,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。anti-miR-145組與Sham組、anti-NC組、DMEM組比較ICP/MAP減小,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2)免疫組化結(jié)果顯示anti-miR-145組陰莖海綿體組織的α-SMA、Calponin表達量較Sham組、anti-NC組、DMEM組減少。3) RT-PCR結(jié)果顯示anti-miR-145組組織的α-SMA、SMMHC、Calponin的mRNA表達量較NC組減少,且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Sham組、anti-NC組、DMEM組各組間比較差異沒有統(tǒng)計學意義。4) Western blot結(jié)果顯示anti-miR-145組組織的α-SMA、SMMHC、Calponin的蛋白表達量較Sham組、anti-NC組、DMEM組減少。結(jié)論1、成功構(gòu)建高效穩(wěn)定表達的沉默及過表達miR-145慢病毒載體,為研究miR-145在CCSMC中的作用提供實驗保障。2、miR-145可抑制CCSMC的增殖及遷移。3、miR-145可抑制CCSMC從收縮型向合成型轉(zhuǎn)化,即抑制表型轉(zhuǎn)化。4、沉默miR-145可致大鼠陰莖勃起功能降低,為進一步研究ED的病因及治療提供依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R698

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本文編號：2237391