【摘要】：研究背景 慢性腎臟病已成為公共衛(wèi)生系統(tǒng)的重大負(fù)擔(dān)[1],不僅給患者和家屬帶來巨大苦痛,也給社會帶來巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。慢性持續(xù)性炎癥是慢性腎臟病(CKD)的一個顯著特征,它是CKD進(jìn)展的一個獨立的危險因素,與患者的預(yù)后不良密切相關(guān)[2]。研究表明：這種慢性持續(xù)性炎癥的存在能夠使促炎癥因子分泌如IL-1、IL-6、TNF-a、hsCRP增加,從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控[3]。慢性腎臟病狀態(tài)下的這種慢性持續(xù)性炎癥的發(fā)生機制,目前還沒有完全闡明。 線粒體被稱為真核細(xì)胞重要的“能量供應(yīng)站”,因為它能夠通過氧化磷酸化作用產(chǎn)生大量的能量供機體代謝所需[4]。在正常細(xì)胞內(nèi),線粒體再生和降解是平衡的,AMPK及PGC1α是線粒體再生和功能的主要調(diào)控因子,當(dāng)PGC1α被AMPK磷酸化或者SIRT1去乙酰化激活時,其下游指標(biāo)如NRF1、NRF2、TFAM等表達(dá)增加,從而使線粒體DNA拷貝數(shù)、線粒體數(shù)量及氧化磷酸化相關(guān)酶如COX、ATP合酶等表達(dá)增加,以此來維持細(xì)胞正常的能量代謝[5],一旦這種平衡受損,則會導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生及細(xì)胞代謝下降[6]。線粒體在營養(yǎng)物質(zhì)利用及能量產(chǎn)生方面起著重要作用,一旦線粒體在細(xì)胞水平功能受損,則會使整個機體代謝平衡紊亂,從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[7]。許多研究表明：線粒體在神經(jīng)退行性變、2型糖尿病、心血管病、癌癥等疾病的形成過程中起著重要的作用,其線粒體再生及功能障礙可能為主要機制之一[5,8,9]。 巨噬細(xì)胞是一種很重要的固有免疫細(xì)胞,它主要有兩種不同的表型：促炎癥因子M1型和抗炎癥因子M2型,M1型巨噬細(xì)胞能夠分泌很多促炎癥因子且有殺菌功能,而M2型巨噬細(xì)胞分泌的抗炎癥因子主要有創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)的作用[10]。研究表明：巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥在許多代謝性疾病如：肥胖、糖尿病等疾病的發(fā)生與發(fā)展中起重要作用,而AMPK是連接巨噬細(xì)胞性炎癥及線粒體代謝的重要樞紐,即AMPK活性的增強能夠減輕巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥,但同時AMPK也是調(diào)控線粒體再生及能量代謝的一個重要原件[11],提示巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥的發(fā)生跟線粒體再生障礙有關(guān)。且最新的研究也發(fā)現(xiàn),線粒體再生在巨噬細(xì)胞活化中發(fā)揮重要作用[12]。線粒體再生障礙可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞炎癥過度活化[13],從而導(dǎo)致許多炎癥性疾病的發(fā)生。 許多研究表明：巨噬細(xì)胞浸潤是許多腎小球及。腎小管疾病的顯著特征[14],且巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥在腎臟病的發(fā)生與發(fā)展中起著重要的作用,例如：M1型巨噬細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-a等促炎癥因子能夠促進(jìn)腎臟結(jié)構(gòu)和功能的損害[15],但這種慢性腎臟病狀態(tài)下巨噬細(xì)胞介導(dǎo)炎癥的發(fā)生機制目前還不清楚。免疫和能量代謝在分子、細(xì)胞、器官及機體水平上是緊密聯(lián)系的,慢性腎臟病也是一種代謝性炎癥性疾病,慢性腎臟病狀態(tài)下巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥是否也跟線粒體再生有關(guān)呢?因此探討代謝性因素激活免疫細(xì)胞的機制對臨床防治代謝性炎癥有重要意義。 本研究的科學(xué)假說：慢性腎臟病作為一種慢性低度炎癥性疾病,它的發(fā)生跟巨噬細(xì)胞線粒體再生障礙有關(guān),我們從巨噬細(xì)胞線粒體再生障礙的角度探討巨噬細(xì)胞活化異常,尋求慢性腎臟病患者代謝性炎癥發(fā)生、發(fā)展的潛在機制。 我們研究了5／6腎切大鼠腹腔來源噬細(xì)胞相線粒體再生相關(guān)指標(biāo)的變化,此外,我們也用尿毒癥血清刺激大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞及人巨噬細(xì)胞THP-1,探討慢性腎功能不全的情況下線粒體再生是否發(fā)生障礙。 同時我們也用AMPK激活劑AICAR刺激及攜帶有AMPK基因的腺病毒轉(zhuǎn)染入正常大鼠腹腔來源的巨噬細(xì)胞,用相關(guān)濃度的尿毒癥血清刺激AMPK活化后的大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞,觀察線粒體再生相關(guān)通路的變化情況,來探討AMPK活化對尿毒癥血清抑制線粒體的干預(yù)作用。 研究方法： 第一部分：慢性腎功能大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞相關(guān)實驗 一、二步法5/6腎切除建立慢性腎衰模型 1、腹腔注射麻醉大鼠：給大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,俯臥位定于鼠臺上。 2、酒精消毒,于大鼠左腹部中1／3脊柱旁開2-3cm處行縱行切口,切口長度約為2-3cm。 3、依次切開皮膚和皮下組織,并剪開肌肉暴露腎臟,剝離腎包膜,用無損傷血管鉗夾住腎蒂,切除腎臟的上下極約占左腎的2/3,明膠海綿壓緊上下極創(chuàng)面止血,放松血管鉗,觀察創(chuàng)面不再滲血后還納腎臟回腹腔,逐層縫合肌層及皮膚,酒精消毒手術(shù)切口。縫合前,腹腔內(nèi)滴注青霉素注射液,預(yù)防感染。假手術(shù)組只做腎包膜剝離術(shù)。 4、一周后,在脊柱右側(cè)中1/3旁開2-3cm縱行切口(切口略高于左側(cè)),分離肌層,游離腎臟,無損傷血管鉗夾住腎蒂,4號絲線結(jié)扎腎蒂,切除右側(cè)腎臟,觀察有無出血,縫合肌層和皮膚,酒精消毒手術(shù)切口。假手術(shù)組只做腎包膜剝離術(shù)。 二、大鼠血、尿的留取及處理 1、術(shù)后第10周,將大鼠放于代謝籠中,留取24小時尿。 2、大鼠腹主動脈采血：腹腔注射麻醉大鼠：給大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,俯臥位定于鼠臺上,用10ml注射器腹主動脈采血,常溫3000rpm離心15min 三、大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的提取 1、乙醚麻醉大鼠致死：術(shù)后第十周,將大鼠放入一密閉容器內(nèi),倒入2-3ml乙醚,麻醉4-5分鐘后,取出大鼠。 2、酒精消毒大鼠：將大鼠放入裝有75%酒精的燒杯中,浸泡消毒5分鐘。 3、腹腔注射冰基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生：用10ml注射劑抽冰基礎(chǔ)培養(yǎng)基注入大鼠腹腔,后輕柔大鼠腹部2-3分鐘,再靜置大鼠8分鐘。 4、腹腔巨噬細(xì)胞的提�。簩⒋笫笃矢�,用lml移液槍抽取大鼠腹腔液體,800rpm5min離心。 四、巨噬細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的檢測 提取Sham組和CRF組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞,按照相關(guān)DNA提取試劑盒說明提取DNA,再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法PCR檢測線粒體DNA拷貝數(shù)。 五、Sham組和CRF組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞線粒體數(shù)量的測定 流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞線粒體數(shù)量。用PBS清洗巨噬細(xì)胞兩遍,后用線粒體染色示蹤劑MitoTracker Green FM100nM在37℃孵箱孵育30分鐘,用含1%胎牛血清的PBS懸浮細(xì)胞,然后上流式細(xì)胞儀檢測,后用相關(guān)軟件分析數(shù)據(jù)。 六、Real-time PCR及Western blotting檢測Sham組和CRF組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)蛋白如：細(xì)胞色素C、細(xì)胞色素C氧化酶及ATP合酶,且Real-time PCR檢測巨噬細(xì)胞線粒體再生轉(zhuǎn)錄因子如：NRF1、NRF2及TFAM mRNA的表達(dá) 將提取Sham組和CRF組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞種入直徑為6.5cm的培養(yǎng)皿,貼壁2小時后,倒掉培養(yǎng)基,用冰PBS洗2遍后,加入700mlTRIZOL,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄,Real-time PCR法檢測細(xì)胞色素C、細(xì)胞色素C氧化酶及ATP合酶、NRF1、NRF2及TFAM mRNA的表達(dá)。 將提取Sham組和CRF組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞種入直徑為6.5cm的培養(yǎng)皿,貼壁2小時后,倒掉培養(yǎng)基,用冰PBS洗2遍后,加入200ul裂解液,冰上孵育15分鐘后,用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下入1.5mlEP管中,4℃12000g10min離心,加入5×SDS上樣緩沖液,100℃煮沸蛋白5min。Western blotting法檢測細(xì)胞色素C、細(xì)胞色素C氧化酶的表達(dá)。 七、Sham組和CRF組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞再生相關(guān)通路蛋白如：P-AMPK/AMPK的檢測 將提取Sham組和CRF組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞種入直徑為6.5cm的培養(yǎng)皿,貼壁2小時后,倒掉培養(yǎng)基,用冰PBS洗2遍后,加入200ul裂解液,冰上孵育15分鐘后,用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下入1.5mlEP管中,4℃12000g10min離心,加入5×SDS上樣緩沖液,100℃煮沸蛋白5min。Western blotting法檢測AMPK活性。 八、Sham組和CRF組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞線粒體再生相關(guān)通路蛋白PGC1α活性檢測 免疫沉淀法檢測PGC1α活性。提取Sham組和CRF組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞蛋白,每組取400ug蛋白,用裂解液調(diào)整為500ul的總體積,每管樣品中加入10ul的抗PGC1α及60ul的瓊脂糖A/G珠,4℃搖床過夜。12000g,4℃離心5min,重復(fù)三次,棄去上清。樣本蛋白與2×SDS上樣緩沖液混勻,100℃水浴煮沸5min變性。Western blotting法檢測PGC1α的活性。 九、統(tǒng)計方法 所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實驗的結(jié)果,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有統(tǒng)計分析由統(tǒng)計軟件SPSS13.0完成。與常數(shù)項比較,采用單樣本t檢驗；兩樣本均數(shù)的比較采用兩獨立樣本t檢驗。p0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 第二部分：尿毒癥血清對大鼠腹腔巨噬細(xì)胞及人巨噬細(xì)胞THP-1線粒體再生的影響 一、尿毒癥血清及正常血清的制備 1、大鼠尿毒癥血清采取Sham組大鼠血清及CRY組大鼠全血,40C3000rpm離心10min,抽取上層血清分裝,—20℃保存?zhèn)溆谩?2、人尿毒癥血清采自本科住院未開始行血液透析及腹膜透析的患者,且年齡在18～45歲之間,病因為慢性腎炎,除外糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等繼發(fā)性因素導(dǎo)致的尿毒癥,正常人血清采自志愿者和本科住院患者(單純血尿、無系統(tǒng)系疾病),要求年齡與尿毒癥病人相仿。留取病人全血標(biāo)本,4℃3000rpm10min,抽取上層血清分裝,—20℃保存?zhèn)溆? 二、細(xì)胞培養(yǎng) 1、大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞的提取及培養(yǎng) 將大鼠放入一密閉容器內(nèi),倒入2-3ml乙醚,麻醉4-5分鐘后,取出大鼠。將大鼠放入裝有75%酒精的燒杯中,浸泡消毒5分鐘。用10ml注射劑抽冰基礎(chǔ)培養(yǎng)基注入大鼠腹腔,后輕柔大鼠腹部2-3分鐘,再靜置大鼠8分鐘。將大鼠剖腹,用1ml移液槍抽取大鼠腹腔液體。800rpm離心5min,吸掉上層1640,用含10%FBS的1640吹打混勻中皿在37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)。 2、THP-1的培養(yǎng) THP-1細(xì)胞復(fù)蘇后在37℃,5%CO2,10%FBS的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),傳代。細(xì)胞狀態(tài)良好時接種于培養(yǎng)皿,待細(xì)胞生長融合至80%后,加入20ng/ml的PMA孵育24小時,再加入不同濃度的尿毒癥血清培養(yǎng)24小時后用于相關(guān)實驗。 三、不同濃度尿毒癥血清對巨噬細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的影響 1、不同濃度尿毒癥血清對大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的影響 提取正常大鼠腹腔巨噬細(xì)胞,用0%、10%、20%的大鼠尿毒癥血清分別刺激腹腔巨噬細(xì)胞24小時后,按照相關(guān)DNA提取試劑盒說明提取DNA,再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法PCR檢測線粒體DNA拷貝數(shù)。 2、不同濃度尿毒癥血清對THP-1線粒體DNA拷貝數(shù)的影響 待THP-1達(dá)到80%融合率的時候,加20ng/ml的PMA孵育24小時后,用0%、10%、20%的尿毒癥血清刺激24小時后,按照相關(guān)DNA提取試劑盒說明提取DNA,再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法PCR檢測線粒體拷貝數(shù)。 四、不同濃度尿毒癥血清對巨噬細(xì)胞線粒體數(shù)目的影響 1、不同濃度尿毒癥血清對大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞線粒體數(shù)目的影響 提取正常大鼠腹腔巨噬細(xì)胞,用0%、10%、20%的大鼠尿毒癥血清分別刺激腹腔巨噬細(xì)胞24小時后,用PBS清洗巨噬細(xì)胞兩遍,后用線粒體染色示蹤劑MitoTracker Green FM100nM在37-C孵箱孵育30分鐘,用含1%胎牛血清的PBS懸浮細(xì)胞,然后上流式細(xì)胞儀檢測,后用相關(guān)軟件分析數(shù)據(jù)流式檢測線粒體數(shù)目。 2、不同濃度尿毒癥血清對THP-1線粒體DNA拷貝數(shù)的影響 待THP-1達(dá)到80%融合率的時候,加20ng/ml的PMA孵育24小時后,用0%、10%、20%的尿毒癥血清刺激24小時后,流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞線粒體數(shù)量。用PBS清洗巨噬細(xì)胞兩遍,后用線粒體染色示蹤劑MitoTracker Green FM100nM在37℃孵箱孵育30分鐘,用含1%胎牛血清的PBS懸浮細(xì)胞,然后上流式細(xì)胞儀檢測,后用相關(guān)軟件分析數(shù)據(jù)。 五、不同濃度尿毒癥血清對巨噬細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)蛋白及線粒體再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA的影響 1、不同濃度尿毒癥血清對大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)蛋白及再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA的影響 提取正常大鼠腹腔巨噬細(xì)胞,用0%、10%、20%的大鼠尿毒癥血清分別刺激腹腔巨噬細(xì)胞24小時后,加入700mlTRIZOL,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄,real-timePCR檢測線粒體結(jié)構(gòu)蛋白的mRNA表達(dá)。如：細(xì)胞色素C、細(xì)胞色素C氧化酶及ATP合酶,和巨噬細(xì)胞線粒體再生轉(zhuǎn)錄因子如：NRF1、NRF2及TFAM mRNA的表達(dá)。 2、不同濃度尿毒癥血清對THP-1線粒體結(jié)構(gòu)蛋白及再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA的影響 待THP-1達(dá)到80%融合率的時候,加20ng/ml的PMA孵育24小時后,用0%、10%、20%的尿毒癥血清刺激24小時后,加入700mlTRIZOL,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄,eal-timePCR檢測線粒體結(jié)構(gòu)蛋白的mRNA表達(dá)。如：細(xì)胞色素C、細(xì)胞色素C氧化酶及ATP合酶,和巨噬細(xì)胞線粒體再生轉(zhuǎn)錄因子如：NRF1、NRF2及TFAM mRNA的表達(dá)。 六、不同濃度尿毒癥血清對巨噬細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)蛋白和線粒體再生相關(guān)通路蛋白的影響 1、不同濃度尿毒癥血清對大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)蛋白和線粒體再生相關(guān)通路蛋白的影響 提取正常大鼠腹腔巨噬細(xì)胞,用0%、10%、20%的大鼠尿毒癥血清分別刺激腹腔巨噬細(xì)胞24小時后,倒掉培養(yǎng)基,用冰PBS洗2遍后,加入200ul裂解液,冰上孵育15分鐘后,用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下入1.5mlEP管中,4℃12000g10min離心,加入5×SDS上樣緩沖液,100℃煮沸蛋白5min。 Western blotting法檢測細(xì)胞色素C、細(xì)胞色素C氧化酶、P-AMPK/AMPK活性。 2、不同濃度尿毒癥血清對THP-1線粒體結(jié)構(gòu)蛋白和線粒體再生相關(guān)通路蛋白的影響 待THP-1達(dá)到80%融合率的時候,加20ng/ml的PMA孵育24小時后,用0%、10%、20%的尿毒癥血清刺激24小時后,倒掉培養(yǎng)基,用冰PBS洗2遍后,加入200ul裂解液,冰上孵育15分鐘后,用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下入1.5mlEP管中,4℃12000g10min離心,加入5×SDS上樣緩沖液,100℃煮沸蛋白5min。 Western blotting法檢測細(xì)胞色素C、細(xì)胞色素C氧化酶、P-AMPK/AMPK活性。 七、統(tǒng)計方法 所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實驗的結(jié)果,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有統(tǒng)計分析由統(tǒng)計軟件SPSS13.0完成。與常數(shù)項比較,采用單樣本t檢驗；方差齊的多個樣本均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA,兩兩比較采用LSD法；方差不齊的多個樣本均數(shù)的比較采用Welch法,兩兩比較采用Dunnett's T3法。p0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 第三部分：AMPK活化對尿毒癥血清抑制線粒體再生的干預(yù)作用 一、AICAR對尿毒癥血清抑制線粒體DNA拷貝數(shù)影響 提取正常大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分別種入四個中皿,貼壁2小時后,用1mM的AICAR刺激其中一皿腹腔巨噬細(xì)胞12小時后換液(其余用正常胎牛血清培養(yǎng)),用大鼠尿毒癥血清刺激24小時,與此同時其余三皿分別用正常血清及尿毒癥血清刺激24小時。24小時后,按照相關(guān)DNA提取試劑盒說明提取DNA,再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法PCR檢測線粒體DNA拷貝數(shù)。 二、AICAR對尿毒癥血清抑制線粒體數(shù)量的影響 提取正常大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分別種入四個中皿,貼壁2小時后,用1mM的AICAR刺激其中一皿腹腔巨噬細(xì)胞12小時后換液(其余用正常胎牛血清培養(yǎng)),用大鼠尿毒癥血清刺激24小時,與此同時其余三皿分別用正常血清及尿毒癥血清刺激24小時。24小時后,用PBS清洗巨噬細(xì)胞兩遍,后用線粒體染色示蹤劑MitoTracker Green FM100nM在37℃孵箱孵育30分鐘,用含1%胎牛血清的PBS懸浮細(xì)胞,然后上流式細(xì)胞儀檢測,后用相關(guān)軟件分析數(shù)據(jù)流式檢測線粒體數(shù)目。 三、AICAR對尿毒癥血清抑制線粒體結(jié)構(gòu)蛋白如細(xì)胞色素C及細(xì)胞色素C氧化酶,和巨噬細(xì)胞線粒體再生相關(guān)通路蛋白如：P-AMPK/AMPK的檢測。 提取正常大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分別種入四個中皿,貼壁2小時后,用1mM的AICAR刺激其中一皿腹腔巨噬細(xì)胞12小時后換液(其余用正常胎牛血清培養(yǎng)),用大鼠尿毒癥血清刺激24小時,與此同時其余三皿分別用正常血清及尿毒癥血清刺激24小時。用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下入1.5mlEP管中,4℃12000g10min離心,加入5xSDS上樣緩沖液,100℃煮沸蛋白5min。 Western blotting法檢測細(xì)胞色素C、細(xì)胞色素C氧化酶、P-AMPK/AMPK活性。 四、AC-AMPK上調(diào)AMPK對尿毒癥血清抑制線粒體DNA拷貝數(shù)影響 提取正常大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分別種入四個中皿,貼壁生長24小時后,A皿加入攜帶有AMPK基因的腺病毒,B皿加入陰性對照病毒,C、D兩皿用含10%的胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后,A、B、C皿加入大鼠尿毒癥血清、D皿加入正常大鼠血清刺激24小時。按照相關(guān)DNA提取試劑盒說明提取DNA,再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法PCR檢測線粒體DNA拷貝數(shù)。 五、AC-AMPK上調(diào)AMPK對尿毒癥血清抑制線粒體數(shù)量影響 提取正常大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分別種入四個中皿,貼壁生長24小時后,A皿加入攜帶有AMPK基因的腺病毒,B皿加入陰性對照病毒,C、D兩皿用含10%的胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后,A、B、C皿加入大鼠尿毒癥血清、D皿加入正常大鼠血清刺激24小時。24小時后,用PBS清洗巨噬細(xì)胞兩遍,后用線粒體染色示蹤劑MitoTracker Green FM100nM在37-C孵箱孵育30分鐘,用含1%胎牛血清的PBS懸浮細(xì)胞,然后上流式細(xì)胞儀檢測,后用相關(guān)軟件分析數(shù)據(jù)流式檢測線粒體數(shù)目。 六、AC-AMPK上調(diào)AMPK對尿毒癥血清抑制線粒體結(jié)構(gòu)蛋白如細(xì)胞色素C及細(xì)胞色素C氧化酶,和巨噬細(xì)胞線粒體再生相關(guān)通路蛋白如：P-AMPK/AMPK的檢測。 提取正常大鼠腹腔巨噬細(xì)胞分別種入四個中皿,貼壁生長24小時后,A皿加入攜帶有AMPK基因的腺病毒,B皿加入陰性對照病毒,C D兩皿用含10%的胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后,A、B、C皿加入大鼠尿毒癥血清、D皿加入正常大鼠血清刺激24小時。用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下入1.5mlEP管中,4℃12000g10min離心,加入5xSDS上樣緩沖液,100℃煮沸蛋白5min。Western blotting法檢測細(xì)胞色素C、細(xì)胞色素C氧化酶、P-AMPK/AMPK活性。 七、統(tǒng)計方法 所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實驗的結(jié)果,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有統(tǒng)計分析由統(tǒng)計軟件SPSS13.0完成。與常數(shù)項比較,采用單樣本t檢驗；方差齊的多個樣本均數(shù)的比較采用One-Way ANOVA,兩兩比較采用LSD法；方差不齊的多個樣本均數(shù)的比較采用Welch法,兩兩比較采用Dunnett's T3法。p0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果 第一部分：5/6腎切大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞相關(guān)實驗 一、腎衰大鼠模型的確立 在二步法5/6腎切除術(shù)后的第10周,采集大鼠尿液和血液測定血肌酐和肌酐清除率。在第10周時,腎衰組大鼠體重、血肌酐及尿素氮與假手術(shù)組相比顯著減少(p0.05)。 二、慢性腎衰對巨噬細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的影響 慢性腎衰抑制巨噬細(xì)胞線粒體DNA的拷貝數(shù),CRF組的線粒體DNA拷貝數(shù)與假手術(shù)組相比顯著性下降(p0.05)。 三、慢性腎衰對巨噬細(xì)胞線粒體數(shù)量的影響 慢性腎衰抑制巨噬細(xì)胞線粒體數(shù)量,CRF組的線粒體數(shù)量與假手術(shù)組相比顯著性下降(P0.05) 四、慢性腎衰對巨噬細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)蛋白影響 1、慢性腎衰巨噬細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)蛋白mRNA的表達(dá)情況CRF組結(jié)構(gòu)蛋白與假手術(shù)組比減弱：細(xì)胞色素C、細(xì)胞色素C氧化酶及ATP合酶(p0.05)。 2、慢性腎衰巨噬細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)情況 CRF組結(jié)構(gòu)蛋白與假手術(shù)相比減弱：細(xì)胞色素C細(xì)胞色素C氧化酶(p0.05)。 五、慢性腎衰對巨噬細(xì)胞線粒體線粒體再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的影響 CRF組巨噬細(xì)胞線粒體再生轉(zhuǎn)錄因子mRNA與假手術(shù)比減弱：NRF1、NRF2及TFAMmRNA的表達(dá)(p0.05)。 六、慢性腎衰大鼠巨噬細(xì)胞AMPK活化情況 CRF組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的P-AMPK與假手術(shù)組相比減弱(P0.05),AMPK總蛋白無變化。 七、慢性腎衰大鼠巨噬細(xì)胞PGC1α活化情況 CRF組大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的AC-PGC1α與假手術(shù)組相比增強(P0.05),PGC1α,總蛋白無變化。結(jié)論：在慢性腎功能不全狀態(tài)下,線粒體再生功能障礙 第二部分：尿毒癥血清對腹腔巨噬細(xì)胞及THP-1細(xì)胞線粒體再生的影響 一、尿毒癥血清對巨噬細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的測定 1、大鼠尿毒癥血清對巨噬細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的影響情況用0%、10%、20%大鼠尿毒癥血清刺激大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞24小時后,隨尿毒癥血清濃度的增加,線粒體DNA拷貝數(shù)是逐漸下降的(P0.05)。 2、人尿毒癥血清對巨噬細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的影響情況用0%、10%、20%人尿毒癥血清刺激人THP-1巨噬細(xì)胞24小時,隨著濃度的增加,線粒體DNA拷貝數(shù)是逐漸下降的(P0.05)。 二、尿毒癥血清對巨噬細(xì)胞線粒體數(shù)量的影響 1、大鼠尿毒癥血清對巨噬細(xì)胞線粒體數(shù)量的影響情況用0%、10%、20%大鼠尿毒癥血清刺激大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞24小時后,隨尿毒癥血清濃度的增加,線粒體數(shù)量是逐漸下降的(P0.05)。 2、人尿毒癥血清對巨噬細(xì)胞線粒體數(shù)數(shù)量的影響情況用0%、10%、20%人尿毒癥血清刺激人THP-1巨噬細(xì)胞24小時,隨著濃度的增加,線粒體數(shù)量是逐漸下降的(P0.05)。 三、尿毒癥血清對巨噬細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)蛋白的影響 1、大鼠尿毒癥血清對大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)蛋白影響 1.1用0%、10%、20%大鼠尿毒癥血清刺激大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞24小時,隨著濃度的增加,線粒體結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)逐漸下降(P0.05)。 1.2用0%、10%、20%大鼠尿毒癥血清刺激大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞24小時,隨著濃度的增加,線粒體結(jié)構(gòu)蛋白的mRNA的表達(dá)逐漸下降((P0.05) 2、人尿毒癥血清對THP-1巨噬細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)蛋白的影響 2.1用0%、10%、20%人尿毒癥血清刺激人THP-1巨噬細(xì)胞24小時,隨著濃度的增加,線粒體結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)逐漸下降(P0.05)。 2.2用0%、10%、20%人尿毒癥血清刺激人THP-1巨噬細(xì)胞24小時,隨著濃度的增加,線粒體結(jié)構(gòu)蛋白mRNA的表達(dá)逐漸下降(P0.05)。 四、尿毒癥血清對巨噬細(xì)胞線粒體再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的影響 1、大鼠尿毒癥血清對大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞線粒體再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子影響 用0%、10%、20%大鼠尿毒癥血清刺激大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞24小時,隨著濃度的增加,線粒體再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)逐漸下降(P0.05)。 2、人尿毒癥血清對THP-1細(xì)胞線粒體再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的影響 用0%、10%、20%人尿毒癥血清刺激人THP-1巨噬細(xì)胞24小時,隨著濃度的增加,線粒體再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)逐漸下降(P0.05)。 五、尿毒癥血清對巨噬細(xì)胞AMPK活性的影響 1、大鼠尿毒癥血清對大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞AMPK活性的影響 用0%、10%、20%人尿毒癥血清刺激大鼠腹腔巨噬細(xì)胞24小時,隨著濃度的增加,P-AMPK的表達(dá)逐漸下降(P0.05), AMPK總蛋白表達(dá)不變。 2、人尿毒癥血清對THP-1細(xì)胞AMPK的影響 用0%、10%、20%人尿毒癥血清刺激人THP-1巨噬細(xì)胞24小時,隨著濃度的增加,P-AMPK的表達(dá)逐漸下降(P0.05), AMPK總蛋白表達(dá)不變。結(jié)論：在體外用尿毒癥血清刺激原代大鼠巨噬細(xì)胞和人THP-1巨噬細(xì)胞時,其線粒體再生也是受抑制的。進(jìn)一步表明在慢性腎功能不全的情況下,巨噬細(xì)胞線粒體再生障礙。 第三部分：AMPK活化對尿毒癥血清抑制線粒體再生的干預(yù)作用 一、AMPK活化對尿毒癥血清刺激組巨噬細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的影響 1、AICAR對尿毒癥血清刺激組巨噬細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)影響 用lmM的AICAR與大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞共同孵育4小時之后,加入20%的大鼠尿毒癥血清孵育24小時,AICAR對尿毒癥血清刺激組巨噬細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)有上調(diào)(P0.05)。 2、攜帶有AMPK基因的腺病毒對尿毒癥血清刺激組巨噬細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的影響。 用攜帶有AMPK基因的腺病毒轉(zhuǎn)染正常大鼠腹腔來源的巨噬細(xì)胞24小時后,再用20%的尿毒癥血清與之共同孵育24小時,受攜帶AMPK基因病毒轉(zhuǎn)染后巨噬細(xì)胞組線粒體DNA拷貝數(shù)上調(diào)(P0.05)。 二、AMPK活化對尿毒癥血清刺激組巨噬細(xì)胞線粒體數(shù)量的影響 1、AICAR對尿毒癥血清刺激組巨噬細(xì)胞線粒體數(shù)量的影響 用1mM的AICAR與大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞共同孵育4小時之后,加入20%的大鼠尿毒癥血清孵育24小時,AICAR對尿毒癥血清刺激組巨噬細(xì)胞數(shù)量有上調(diào)(P0.05)。 2、攜帶有AMPK基因的腺病毒對尿毒癥血清刺激組巨噬細(xì)胞線粒體數(shù)量的影響。 用攜帶有AMPK基因的腺病毒轉(zhuǎn)染正常大鼠腹腔來源的巨噬細(xì)胞24小時后,再用20%的尿毒癥血清與之共同孵育24小時,受攜帶AMPK基因病毒轉(zhuǎn)染后巨噬細(xì)胞組線粒體數(shù)量上調(diào)(P0.05) 三、AMPK活化對尿毒癥血清刺激組巨噬細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)蛋白的影響 1、AICAR對尿毒癥血清刺激組巨噬細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)蛋白的影響 用1mM的AICAR與大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞共同孵育4小時之后,加入20%的大鼠尿毒癥血清孵育24小時,AICAR對尿毒癥血清刺激組巨噬細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)蛋白有上調(diào)(P0.05)。 2、攜帶有AMPK基因的腺病毒對尿毒癥血清刺激組巨噬細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)蛋白的影響。 用攜帶有AMPK基因腺病毒轉(zhuǎn)染正常大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞24小時后,再用20%尿毒癥血清與之共同孵育24小時,受攜帶AMPK基因病毒轉(zhuǎn)染后巨噬細(xì)胞組線粒體結(jié)構(gòu)蛋白上調(diào)(P0.05)。 四、AMPK活化對尿毒癥血清刺激組巨噬細(xì)胞AMPK活性的影響 1、AICAR對尿毒癥血清刺激組巨噬細(xì)胞AMPK活性的影響 用1mM的AICAR與大鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞共同孵育4小時之后,加入20%的大鼠尿毒癥血清孵育24小時,AICAR對尿毒癥血清刺激組巨噬細(xì)胞AMPK活性增強(P0.05)。 2、攜帶有AMPK基因的腺病毒對尿毒癥血清刺激組巨噬細(xì)胞AMPK活性的影響。 用攜帶有AMPK基因的腺病毒轉(zhuǎn)染正常大鼠腹腔來源的巨噬細(xì)胞24小時后,再用20%的尿毒癥血清與之共同孵育24小時,受攜帶AMPK基因病毒轉(zhuǎn)染后巨噬細(xì)胞組活性增強(P0.05)。 結(jié)論：當(dāng)上調(diào)AMPK時,尿毒癥血清對巨噬細(xì)胞線粒體再生的抑制作用被削弱。AMPK、PGC1α是調(diào)控巨噬細(xì)胞線粒體再生的重要的調(diào)控因子。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R692

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1 李聰;慢性腎功能不全對巨噬細(xì)胞線粒體再生的影響及機制[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

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本文編號：2204111