【摘要】：腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)發(fā)展到終末尿毒癥期的共同途徑，它以過量細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)在腎間質(zhì)積聚及腎間質(zhì)成纖維細胞增生為特征。既往研究表明，由成纖維細胞分化形成的肌成纖維細胞是分泌ECM的主要來源，而腎小管上皮細胞重塑可以導致細胞完整性破壞并出現(xiàn)肌成纖維細胞表型，同樣促進Ⅰ型和Ⅲ型膠原等基質(zhì)蛋白合成。因此，抑制成纖維細胞增生、分化以及腎小管上皮細胞重塑是減少肌成纖維細胞數(shù)量和ECM合成的重要途徑，對相關(guān)機制和干預措施的探討將為防治腎間質(zhì)纖維化提供新策略和新靶點。 成纖維細胞生長因子2(basic fibroblast growth factor-2, FGF2)參與多種細胞增生和分化，在腎臟發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要作用，在腎小球內(nèi)皮細胞，系膜細胞，腎小管上皮細胞和腎間質(zhì)都可以檢測到FGF2的表達。近年研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生和發(fā)展可能密切相關(guān)，它可以誘導腎小管上皮細胞出現(xiàn)肌成纖維細胞表型，誘導肌成纖維細胞標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和波形蛋白(vimentin)表達增高，并釋放基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9和MMP-2，同時抑制上皮細胞標志物細胞角蛋白(cytokeratin)和E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達。不僅如此，有研究提示轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)可以促進成纖維細胞FGF2生成，F(xiàn)GF2隨后以自分泌的方式促進成纖維細胞增生，故有學者認為TGF-β1誘導腎間質(zhì)纖維化的過程主要是由FGF2介導的。FGF2的生物學功能是通過與其受體FGFR(FGFR1-4)結(jié)合而實現(xiàn)的，其中FGFR1在腎臟組織高表達，但到目前為止，F(xiàn)GF2信號通路促腎間質(zhì)纖維化中的作用和機制仍未完全闡明，而對FGF2/FGFR信號通路活性的有效調(diào)控可能是抑制腎間質(zhì)纖維化的重要途徑。 Klotho主要在腎小管上皮細胞表達，其分泌型蛋白是一種激素樣物質(zhì)，可以進入血液循環(huán)作為體液因子調(diào)節(jié)靶細胞功能，該基因敲除小鼠與慢性腎衰竭患者的表型及其相似，腎臟出現(xiàn)明顯的間質(zhì)纖維化。近年來，Klotho與腎臟疾病的關(guān)系引起了我們和其他學者的關(guān)注，許多研究證實Klotho可以保護腎臟功能，延緩腎臟衰老，但在CKD時，腎組織中Klotho表達水平卻顯著降低。值得關(guān)注的是，Klotho與成纖維細胞生長因子家族(FGFs)有著密切關(guān)聯(lián)，Klotho蛋白的主要配體即是FGFs的受體FGFR，它可以與細胞表面所有1-4型的FGFR進行結(jié)合，并發(fā)揮調(diào)節(jié)FGFS信號通路的作用。Klotho結(jié)合FGFR后，可以顯著促進FGF23，F(xiàn)GF19和FGF21與FGFR的結(jié)合，增強這些信號通路的活性；而對于FGF2，Klotho可與其競爭結(jié)合FGFR，并有可能因此抑制FGF2信號通路活性。我們推測，在正常情況下，機體內(nèi)Klotho與FGF2信號通路之間可能處于相對平衡狀態(tài)，但在CKD時，腎臟Klotho表達降低則有可能導致其對FGF2信號通路的抑制作用減弱，F(xiàn)GF2信號增強會誘導腎小管上皮細胞發(fā)生表型改變，成纖維細胞亦會增生、分化成為肌成纖維細胞，并過度生成ECM，最終導致腎間質(zhì)纖維化。所以，Klotho對FGF2信號通路的調(diào)控可能在腎間質(zhì)纖維化過程中發(fā)揮著及其重要的作用，對相關(guān)機制的深入研究將有助于進一步揭示腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生機理，并為尋找有效的防治措施提供理論依據(jù)。 為此，本課題以腎小管上皮細胞(HK-2)和腎成纖維細胞(NRK-49F)為體外研究對象，并利用FGF2基因敲除小鼠和C57BL/6小鼠制備單側(cè)輸尿管梗阻模型，分為以下三個部分對Klotho調(diào)控FGF2/FGFR信號通路在腎間質(zhì)纖維化中的作用及機制進行了研究：(1)首先明確FGF2誘導腎小管上皮細胞重塑和成纖維細胞增生、分化的作用及可能機制，觀察Klotho是否可以通過調(diào)控FGF2信號通路抑制FGF2的上述作用，并分析兩者之間的相互影響；(2)評價FGF2基因敲除小鼠制備單側(cè)輸尿管梗阻模型后Klotho表達和腎間質(zhì)纖維化情況，進一步證實FGF2信號通路在腎間質(zhì)纖維化中的重要作用；(3)制備單側(cè)輸尿管梗阻模型小鼠，通過外源性給予Klotho，進一步探討Klotho對FGF2/FGFR信號通路和腎間質(zhì)纖維化的抑制作用。 主要研究結(jié)果及結(jié)論如下： 1. FGF2誘導腎小管上皮細胞重塑的同時Klotho表達下調(diào)： 人近曲小管上皮細胞HK-2經(jīng)重組人FGF2蛋白處理48h后，出現(xiàn)一系列表型改變，如細胞變長、分叉，失去原來的鵝卵石樣形態(tài)，且具有劑量依賴性。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)FGF2可劑量依賴性的誘導HK-2細胞上皮標志物E-cadherin表達降低，而肌成纖維細胞標志物α-SMA和FSP-1表達上調(diào)，這說明HK-2細胞經(jīng)歷了從小管上皮細胞表型向致纖維化的肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化。與此同時，F(xiàn)GF2處理HK-2細胞后，Klotho mRNA及蛋白水平均明顯下降并呈劑量依賴性，提示小管上皮細胞發(fā)生重塑的同時Klotho在該細胞的表達亦會顯著下調(diào)。 2. FGF2誘導的小管上皮細胞重塑與ERK1/2信號活化有關(guān)，并且Klotho可以抑制FGF2的作用和ERK1/2活化： Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，100ng/ml FGF2處理HK-2細胞5-10min后磷酸化的FRS2α(ERK1/2上游基因)及ERK1/2表達明顯增高，而ERK1/2抑制劑U0126(20μM)預孵育可顯著抑制FGF2誘導的E-cadherin表達降低及α-SMA和FSP-1表達上調(diào)。提示ERK1/2激活在FGF2誘導小管上皮細胞重塑過程中發(fā)揮著重要作用。而200pM和400pM的重組人Klotho蛋白預孵育30min可顯著抑制FGF2誘導的FRS2α和ERK1/2活化，同時減弱了FGF2誘導E-cadherin表達降低及α-SMA和FSP-1表達上調(diào)的作用。免疫熒光染色進一步發(fā)現(xiàn)，Klotho蛋白預孵育可以抑制FGF2誘導的HK-2細胞cytokeratin表達減弱及vimentin表達增強。上述結(jié)果表明，ERK1/2信號活化可能介導了FGF2誘導的腎小管上皮細胞重塑，而Klotho蛋白可以顯著抑制FGF2誘導小管上皮細胞重塑的作用。 3. Klotho抑制FGF2誘導小管上皮細胞重塑的作用是通過與FGF2競爭結(jié)合FGFR1而實現(xiàn)的 為了闡明Klotho抑制FGF2誘導小管上皮細胞重塑的可能機制，我們首先通過Western blot檢測了Klotho對HK-2細胞FGF2表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)400pM Klotho并不能直接抑制小管上皮細胞FGF2的表達，但卻可以抑制TGF-β1誘導的FGF2表達上調(diào)。為了明確Klotho對FGF2誘導小管上皮細胞重塑的抑制作用是否是通過阻斷TGF-β1信號而間接實現(xiàn)的，我們利用LY-364947(TGF-β1Ⅰ型受體ALK5的抑制劑)預孵育后再用Klotho和FGF2順序孵育HK-2細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10μM的LY-364947預孵育并不影響Klotho對FGF2誘導的E-cadherin表達下調(diào)和α-SMA及FSP-1表達上調(diào)的抑制作用，說明Klotho對FGF2誘導小管上皮細胞重塑的抑制作用并不是通過干預TGF-β1信號通路而介導的。 鑒于Klotho與FGFs信號之間的關(guān)系，我們利用免疫共沉淀分析HK-2細胞中Klotho和FGF2與受體FGFR1的結(jié)合情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Klotho蛋白可以明顯減弱FGF2和FGFR1的結(jié)合能力。由于Klotho可以增加FGF23與FGFR1的親和力，而腎臟FGF23表達在CKD時明顯增高，所以我們同時觀察了FGF23、FGF2和Klotho共存時與FGFR1相互結(jié)合的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FGF23的存在并不能抑制甚至輕度增加了Klotho與FGF2競爭性結(jié)合FGFR1的能力。因此，這些研究結(jié)果證實Klotho抑制FGF2誘導小管上皮細胞重塑的作用可能是通過與其競爭結(jié)合FGFR1而實現(xiàn)的。 4. Klotho還可以抑制FGF2誘導的成纖維細胞增生及向肌成纖維細胞分化： 由于FGF2的另一重要效應(yīng)是誘導成纖維細胞增生和分化，我們進一步觀察了Klotho對FGF2誘導成纖維細胞增生與分化的影響。CCK-8檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10ng/ml FGF2孵育72h可以顯著誘導腎臟成纖維細胞NRK-49F增生，而400pM Klotho預孵育幾乎可以完全阻斷該效應(yīng)。同時，Western blot檢測提示FGF2誘導的肌成纖維細胞標志物α-SMA和ECM蛋白Fibronectin表達增高也可以被Klotho抑制。說明Klotho同樣可以抑制FGF2誘導的成纖維細胞增生和分化。 5. FGF2基因敲除小鼠制備單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型后腎間質(zhì)纖維化較野生小鼠明顯減輕， Klotho表達下調(diào)和ERK1/2活化亦明顯減弱： 為了明確FGF2在腎間質(zhì)纖維化過程中的關(guān)鍵作用以及與Klotho的關(guān)系，我們采用FGF2基因敲除小鼠制備UUO模型進行了相關(guān)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后14天FGF2-/-小鼠梗阻側(cè)腎臟的Klotho水平明顯高于野生型小鼠，而ERK1/2信號活化卻較野生型小鼠明顯減弱；Masson染色發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2-/-小鼠的腎間質(zhì)纖維化較野生型小鼠明顯減輕；免疫化學和Western blot檢測證實，與野生型UUO小鼠相比，F(xiàn)GF2-/-小鼠腎臟E-cadherin表達降低、α-SMA和Ki67雙陽性染色的間質(zhì)細胞數(shù)量增多及fibronectin表達增加均明顯減輕。上述結(jié)果說明，F(xiàn)GF2在腎間質(zhì)纖維化過程中扮演著重要角色，當該基因缺失時，腎間質(zhì)纖維化明顯減輕，同時Klotho表達降低和ERK1/2信號活化均明顯減弱，提示FGF2信號通路活化與Klotho之間的相互影響可能是腎間質(zhì)纖維化的重要因素。 6. UUO模型小鼠Klotho表達明顯降低，而FGF2表達顯著增加；Klotho蛋白腹腔注射可以明顯減輕UUO小鼠腎間質(zhì)纖維化并抑制FGF2信號通路活化： 為了進一步明確FGF2在腎間質(zhì)纖維化中的關(guān)鍵作用以及Klotho與FGF2的相互關(guān)系，我們首先檢測了C57BL/6J小鼠UUO模型腎間質(zhì)纖維化過程中Klotho及FGF2表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UUO術(shù)后梗阻側(cè)腎臟Klotho水平逐漸下降，并且在術(shù)后第14天時降低最明顯，而梗阻側(cè)腎臟FGF2表達則在術(shù)后第7天和第14天明顯上升。此結(jié)果提示，Klotho表達降低和FGF2表達升高的確與腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān)。 為了闡明Klotho是否可以抑制腎間質(zhì)纖維化，在本研究中，UUO模型小鼠術(shù)后立即給予不同劑量的重組小鼠Klotho蛋白(0.01mg/kg/48h和0.02mg/kg/48h)腹腔注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UUO小鼠術(shù)后14天梗阻側(cè)腎臟α-SMA及fibronectin mRNA表達較假手術(shù)組明顯升高，而兩種劑量的Klotho蛋白腹腔注射均可抑制α-SMA及fibronectin mRNA表達上調(diào)，0.02mg/kg/48h Klotho蛋白組的作用略強，但UUO模型注射0.01mg/kg Klotho蛋白組與UUO模型注射Vehicle(注射同等體積的0.01M PBS)組相比，α-SMA及fibronectin表達已顯著下調(diào)，故后續(xù)實驗小鼠均選擇0.01mg/kg/48h Klotho蛋白腹腔注射。 腎臟HE和Masson染色證實，Klotho可以明顯改善梗阻側(cè)腎臟的病變程度和間質(zhì)纖維化。同時，免疫化學染色和Western blot檢測提示Klotho腹腔注射明顯抑制了UUO模型小鼠腎組織E-cadherin的表達降低、α-SMA和Ki67免疫熒光雙染陽性的間質(zhì)細胞增多以及fibronectin表達增高。不僅如此，我們還發(fā)現(xiàn)Klotho腹腔注射能夠顯著降低UUO小鼠梗阻側(cè)腎臟中FGF2的表達以及FRS2α和ERK1/2的活化。上述結(jié)果證實Klotho腹腔注射可以顯著抑制UUO模型小鼠的腎間質(zhì)纖維化，減輕小管上皮細胞重塑、間質(zhì)成纖維細胞增生以及ECM蛋白積聚，其作用可能與抑制了FGF2信號通路活化有關(guān)。 綜上所述，我們的研究結(jié)果提示，F(xiàn)GF2可以通過誘導腎小管上皮細胞重塑和成纖維細胞增生和分化促進腎間質(zhì)纖維化，其誘導小管上皮細胞重塑的作用可能與ERK1/2活化有關(guān)；而Klotho可以通過與FGF2競爭結(jié)合FGFR1抑制FGF2信號通路活性，從而改善腎間質(zhì)纖維化。但在腎間質(zhì)纖維化過程中，，隨著腎小管上皮細胞重塑的發(fā)生，Klotho的表達卻明顯降低，而外源性補充Klotho或上調(diào)Klotho表達則可以顯著阻遏腎間質(zhì)纖維化的進展。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R692

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本文編號：2141255