【摘要】：背景與目的：ED是指陰莖不能達(dá)到和(或)維持足夠的勃起以完成滿意的性生活,且病程持續(xù)6個(gè)月以上。陰莖勃起是一個(gè)由神經(jīng)發(fā)動(dòng)的動(dòng)脈供血、海綿體儲(chǔ)血的綜合過(guò)程,由NOS以左旋精氨酸為底物催化生成的NO,是導(dǎo)致血管擴(kuò)張、海綿體舒張的主要信使,參與勃起的誘導(dǎo)和維持。DDAH2蛋白是維持血管內(nèi)皮功能的重要因子,廣泛表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞以及血管外膜組織等多種血管壁成分中。通過(guò)有絲分裂或是減數(shù)分裂來(lái)傳遞非DNA序列信息的現(xiàn)象稱為表觀遺傳,DNA甲基化是表觀遺傳的重要組成部分。研究證實(shí),DDAH2基因甲基化的修飾參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的維持。因此,本研究擬研究高同型半胱氨酸血癥ED大鼠中DDAH2的表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平,并通過(guò)給予甲基化抑制劑5-aza處理ED大鼠,對(duì)DDAH2甲基化與ED的關(guān)系進(jìn)行研究,了解DDAH2基因甲基化在ED中的作用及其機(jī)制,探索去甲基化劑治療ED的可能性和方法。第一部分實(shí)驗(yàn)：高同型半胱氨酸勃起功能障礙大鼠模型的建立及表觀遺傳學(xué)機(jī)制探討實(shí)驗(yàn)方法：1、SD大鼠分組：正常飼料喂養(yǎng)組(對(duì)照組),正常飼料+4%蛋氨酸喂養(yǎng)(蛋氨酸組)。喂養(yǎng)6周后,測(cè)定ICP、MAP后,取材,保存。2、勃起功能評(píng)價(jià)：利用電刺激大鼠盆腔星狀神經(jīng)節(jié)法測(cè)定陰莖海綿體內(nèi)壓測(cè)定(ICP),頸動(dòng)脈穿刺測(cè)定平均動(dòng)脈壓(MAP), ICP/MAP作為勃起功能的評(píng)價(jià)指標(biāo)；3、組織學(xué)改變：免疫組化觀察各組大鼠陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞數(shù)量結(jié)構(gòu)變化,馬松染色觀察膠原纖維變化；3、 Hey:Elisa法測(cè)定不同組別大鼠血清中Hcy、 ADMA水平；4、 NO/cGMP通路改變：利用NO、cGMP試劑盒測(cè)定陰莖海綿體中NO、 cGMP含量；5、焦磷酸鹽測(cè)序法檢測(cè)各組大鼠血液和陰莖海綿體DDAH2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：SD大鼠高蛋氨酸飲食6周后,血清同型半胱氨酸明顯高于對(duì)照組,且大鼠勃起功能(ICP/MAP)降低。NO、cGMP含量變化與勃起功能一致。較之正常對(duì)照組,蛋氨酸組平滑肌及內(nèi)皮含量減少,并且膠原纖維增多。蛋氨酸組大鼠血液和陰莖組織DNA DDAH2基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化程度高于對(duì)照組。結(jié)論：高蛋氨酸飲食可造成高同型半胱氨酸血癥ED模型。NO/cGMP通路活性降低可能是導(dǎo)致高同型半胱氨酸ED的原因。作為一種血管內(nèi)皮保護(hù)因子,DDAH2與其調(diào)控的NO/cGMP通路改變與勃起功能一致。推測(cè)DDAH2啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)改變與高同型半胱氨酸ED的發(fā)病有關(guān)。第二部分實(shí)驗(yàn)：甲基化調(diào)控對(duì)高同型半胱氨酸氨酸大鼠勃起功能影響研究實(shí)驗(yàn)方法1.實(shí)驗(yàn)分組：正常飼料喂養(yǎng)組(對(duì)照組),正常飼料+4%蛋氨酸喂養(yǎng)(蛋氨酸組),正常飼料+4%蛋氨酸喂養(yǎng)+5-氮雜脫氧胞苷(5-aza組)。5-aza組除給予正常飼料+4%蛋氨酸組喂養(yǎng)外,每隔3天給予5-aza 1.5mg/kg腹腔注射；喂養(yǎng)6周后,測(cè)定ICP、 MAP后,取材,保存。2.療效觀測(cè)：1)、勃起功能測(cè)定：利用電刺激大鼠盆腔星狀神經(jīng)節(jié)法測(cè)定陰莖海綿體內(nèi)壓測(cè)定(ICP),頸動(dòng)脈穿刺測(cè)定平均動(dòng)脈壓(MAP), ICP/MAP作為勃起功能的評(píng)價(jià)指標(biāo)；2)、組織學(xué)觀察：免疫組化觀察各組大鼠陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞數(shù)量結(jié)構(gòu)變化；馬松染色觀察膠原纖維變化；3.機(jī)制探索：1)、各組大鼠陰莖海綿體Hey、 ADMA;2)、各組大鼠甲基化供體SAM含量；3)、各組大鼠陰莖海綿體中DDAH2-mRNA變化；4)、各組大鼠陰莖海綿體中DDAH2表達(dá)；5)、NO-cGMP通路：測(cè)定各組大鼠陰莖海綿體中NO、 cGMP含量；6)、測(cè)定各組大鼠血液和陰莖海綿體DDAH2基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)的變化；實(shí)驗(yàn)結(jié)果：甲基化抑制劑5-aza治療能夠改善勃起功能(ICP/MAP),提高陰莖組織中NO、 cGMP含量,提高平滑肌及內(nèi)皮細(xì)胞含量,5-aza同樣可以逆轉(zhuǎn)DDAH2啟動(dòng)子區(qū)域甲基化改變,并且與DDAH2-mRNA和DDAH2蛋白表達(dá)改變一致。DDAH2啟動(dòng)子區(qū)域甲基化參與了高同型半胱氨酸ED的發(fā)生,甲基化抑制劑5-aza可改善高同型半胱氨酸ED大鼠的勃起功能。結(jié)論：DDAH2基因甲基化在高同型半胱氨酸ED發(fā)病中具有重要作用。DDAH2基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化通過(guò)調(diào)控DDAH2-mRNA和DDAH2蛋白以及NO/cGMP活性的途徑參與高同型半胱氨酸ED的發(fā)生、進(jìn)展。由于甲基化的可逆轉(zhuǎn)性,為臨床治療ED提供了新的靶點(diǎn)。
[Abstract]:Background and purpose: ED means that the penis can not achieve and (or) maintain a sufficient erection to complete a satisfactory sexual life, and the course of the disease lasts more than 6 months. The erection of the penis is a blood supply from the nerves waging, the synthesis process of the cavernous body, the NO catalyzed by NOS with levoarginine as the base, which leads to vasodilatation and corpus cavernosus The main messenger of Zhang, which participates in the erectile induction and maintenance of.DDAH2 protein, is an important factor in the maintenance of vascular endothelial function, widely expressed in various vascular wall components such as endothelial cells, vascular smooth muscle cells and epicardial tissue. The phenomenon of transmission of non DNA sequence information through mitosis or meiosis is called epigenetic, DNA Methylation is an important part of epigenetics. Studies have shown that the modification of DDAH2 gene methylation participates in the maintenance of vascular endothelial cell function. Therefore, this study intends to study the expression of DDAH2 in ED rats with hyperhomocysteinemia and the level of methylation in the promoter region, and to treat ED rats by the administration of methylation inhibitor 5-aza. Study the relationship between DDAH2 methylation and ED, understand the role and mechanism of DDAH2 gene methylation in ED, explore the possibility and method of treating ED with demethylation agent. First part experiment: establishment of Hyperhomocysteine erectile dysfunction rat model and epigenetic mechanism study methods: 1, SD rats group: positive The normal feed group (control group), normal feed +4% methionine feeding (methionine group). After feeding for 6 weeks, ICP, MAP, ICP, preservation, erectile function evaluation: using electrical stimulation of the pelvic stellate ganglion method for the determination of penile corpus cavernosum internal pressure (ICP), carotid artery puncture mean arterial pressure (MAP), ICP/MAP as an erectile function 3, histological changes: immunohistochemical observation of the cavernous endothelial cells in the corpus cavernosum, the changes of the number and structure of smooth muscle cells, the changes of collagen fiber by Masson staining, and the determination of Hcy, ADMA in the serum of different groups of rats by the method of Hey:Elisa; 4, the change of the NO/cGMP pathway: the use of NO and cGMP kit to determine the penis sponge. The content of NO and cGMP in the body; 5, pyrophosphate sequencing method was used to detect the methylation status of CpG island in the promoter region of the DDAH2 gene of the cavernous corpus cavernosum of the rats. The results were as follows: after 6 weeks of high methionine diet in SD rats, the serum homocysteine was significantly higher than that of the control group, and the erectile function (ICP/MAP) decreased the.NO, cGMP content and erectile function in the rat. Consistent. Compared with normal control group, the content of smooth muscle and endothelium in methionine group decreased and collagen fiber increased. Methionine group DNA DDAH2 gene promoter region CpG island methylation level was higher than that of control group. Conclusion: high methionine diet can cause the.NO/cGMP pathway of hyperhomocysteinemia ED model to decrease the activity of.NO/cGMP pathway. Low may be the cause of high homocysteine ED. As a vascular endothelial protective factor, DDAH2 and its regulated NO/cGMP pathway change with erectile function. It is speculated that the change of methylation status in the DDAH2 promoter region is related to the pathogenesis of high homocysteine ED. The second part is verified by methylation regulation of homocysteine Experimental methods 1. groups: normal feed feeding group (control group), normal feed +4% methionine feeding (methionine group), normal feed +4% methionine feeding +5- n-hetero deoxycytidine (group 5-aza).5-aza group fed with normal feed +4% methionine group and 5-aza 1.5mg/kg peritoneal injection every 3 days after feeding in normal feed group (control group) Shoot, after feeding for 6 weeks, after measuring ICP, MAP, materials, preservation of.2. efficacy observation: 1), erectile function determination: using electrical stimulation of rat pelvic stellate ganglion method to determine the internal pressure of corpus cavernosum (ICP), carotid artery puncture mean arterial pressure (MAP), ICP/MAP as the evaluation index of erectile function; 2) histological observation: immunohistochemical observation The number and structure of smooth muscle cells in the cavernous corpus cavernosum and the changes of the smooth muscle cells were observed in each group. The changes of collagen fibers were observed by Masson staining; 3. mechanism was explored: 1), the penis corpus cavernosum Hey, ADMA; 2), the SAM content of the methylation donor in the rats in each group, 3), the changes of DDAH2-mRNA in the cavernous corpus cavernosum in each group, 4), 4), each group of the cavernous corpus cavernosum DDAH2 expression; 5), NO-cGMP pathway: Determination of NO, cGMP content in the corpus cavernosum of rats and the changes in the methylation status of the DDAH2 gene promoter region of the cavernous corpus cavernosum in each group; experimental results: the methylation inhibitor 5-aza can improve the erectile function (ICP/MAP), improve the NO, cGMP content in the penis tissue. Quantity, increase the content of smooth muscle and endothelial cells, 5-aza can also reverse the methylation of DDAH2 promoter region, and the methylation of.DDAH2 promoter region is involved in the occurrence of high homocysteine ED, and the methylation inhibitor 5-aza can improve the erectile function of high homocysteine ED rats. Conclusion: methylation of DDAH2 gene plays an important role in the pathogenesis of high homocysteine ED. Methylation of.DDAH2 gene promoter region is involved in the development of high homocysteine ED through the regulation of DDAH2-mRNA and DDAH2 protein and NO/cGMP activity. The reversible transfer of methylation provides a new target for the clinical treatment of ED.
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R698

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本文編號(hào)：2134432