本文選題：IgA腎病 + 腭扁桃體　； 參考：《中南大學》2014年博士論文

【摘要】：研究背景： IgA腎病(IgA nephropathy, IgAN)又稱Berger病,1968年由Berger和Hinglais使用免疫熒光技術對持續(xù)鏡下血尿的患者進行腎活檢時第一次描述,目前IgA腎病已被世界公認為最常見的原發(fā)性腎小球疾病。IgA腎病主要臨床表現(xiàn)為血尿、蛋白尿和腎功能進行性損害,超過40%的患者在20年內進展為終末期腎病。本病確診需要腎活檢病理檢查,特征性病理表現(xiàn)為腎小球系膜區(qū)沉積IgAl和低糖基化IgAl聚合體形成的免疫復合物,可伴有IgG和/或IgM及補體成分沉積。 國內外學者對IgA腎病的發(fā)病機制進行了較多研究,有學者認為IgA腎病發(fā)病的病理生理過程經歷四個階段：第一步為分泌IgAl的細胞亞群產生低糖基化IgAl增加,第二步為產生針對重鏈可變區(qū)半乳糖基缺陷IgAl的抗多聚糖特異性抗體；第三步為產生的特異性抗體與低糖基化IgAl形成循環(huán)免疫復合物；第四步為循環(huán)免疫復合物沉積于腎小球系膜,活化腎小球系膜細胞及補體系統(tǒng),介導腎小球損傷。由此可見,低糖基化IgAl是IgA腎病發(fā)病的始動因子。 近年來,有研究證實IgA腎病發(fā)病與扁桃體粘膜免疫功能紊亂關系密切。IgA腎病患者腭扁桃體分泌IgAl和J鏈陽性IgA的淋巴細胞增多,產生的低糖基化IgAl與腎小球系膜區(qū)沉積的IgAl高度一致,提示腎小球系膜區(qū)沉積的低糖基化IgAl可能部分來源于扁桃體。我們前期研究發(fā)現(xiàn)IgA腎病患者行腭扁桃體摘除術后72小時,血清IgA和IgAl水平顯著增高,尿檢紅細胞和蛋白均增高,可能由于IgA腎病患者在感染、牽拉、擠壓腭扁桃體等刺激情況下,腭扁桃體分泌IgAl細胞產生大量IgAl,進入循環(huán)沉積于腎小球導致尿檢惡化。長期隨訪觀察顯示行腭扁桃體切除術患者尿檢改善,血尿、蛋白尿得到緩解,血清IgA及IgAl水平顯著降低。此外,一些臨床對照研究也證實IgA腎病患者行腭扁桃體摘除術后尿檢正常率、腎功能穩(wěn)定率和腎臟存活率均高于未切除組,循環(huán)中IgA水平明顯下降。 MicroRNA (miRNA)是真核生物中一類具有內源性調控功能的非編碼RNA,大小19-23bp,通過種子序列(seed sequence)與目標mRNA的3'-UTR區(qū)互補結合,降解目標mRNA或抑制其蛋白翻譯,對目標基因進行轉錄后調控。目前研究表明miRNA在免疫細胞發(fā)育、活化、炎癥產生及免疫耐受過程中起重要作用。B細胞發(fā)育過程需要miRNAs調控,敲除Dicer酶的小鼠缺乏B細胞,Dicer酶是niRNA生物合成過程中的關鍵酶。深度測序技術(deep sequencing)證實miR-181家族選擇性表達于早期和過渡期B細胞階段,miR-181a抑制促凋亡基因BIM,減少B細胞凋亡；同時發(fā)現(xiàn)niR-146a,miR-155和miR-34a選擇性表達于B細胞,調節(jié)B細胞分化。這些miRNA參與生發(fā)中心反應和記憶B細胞應答,其表達下調能夠改變B細胞穩(wěn)態(tài),破壞免疫耐受,促進自身抗體的產生。IgA腎病是一種自身免疫性疾病,IgA腎病患者腭扁桃體粘膜免疫處于激活狀態(tài),我們推測miRNA參與調控粘膜異常免疫反應。 TLR4是模式識別受體,屬于Toll樣受體家族(TLRs),表達于多種免疫細胞表面,可識別革蘭陰性細菌脂多糖(LPS)、熱休克蛋白、纖維蛋白原等。TLR4與配體結合后,活化干擾素調節(jié)因子IRF-3/IRF-7和NF-κB轉錄因子,引起細胞因子、趨化因子、細胞表面粘附分子和共刺激分子產生增加,同時促進固有免疫和適應性免疫應答及炎癥反應。多個研究發(fā)現(xiàn)對IgA腎病患者外周血淋巴細胞加以LPS刺激,檢測p-1,3-半乳糖轉移酶酶(C1GALT)和COSMC活性降低,我們前期研究也發(fā)現(xiàn)LPS刺激腭扁桃體單個核細胞后,促進Th0朝向Thl分化,細胞培養(yǎng)上清液IgAl含量明顯增高,提示LPS刺激促進腭扁桃體單個核細胞產生IgA1。LPS/TLR4信號通路活化已被證實對B細胞發(fā)育和分化成熟過程起輔助刺激作用。由此我們推測,IgA腎病患者腭扁桃體可能存在TLR4高表達,通過調控B細胞的分化和成熟,促進低糖基化IgAl產生。 本實驗研究首次采用芯片技術對IgA腎病患者腭扁桃體miRNA表達譜進行分析,鑒定與非腎病扁桃體炎患者miRNA的差異表達,發(fā)現(xiàn)IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞miR-630表達明顯降低,與IgAl表達及IgAl低糖基化相關。使用Targetscan、miRanda、PICTA5三個軟件對miRNA-630進行靶基因預測,DAVID數(shù)據(jù)庫對候選靶基因進行GO (Gene Ontology)功能分析,提示TLR4是rniR-630的預測靶基因,miR-630可能結合于TLR43'-UTR區(qū)降解TLR4mRNA或抑制其蛋白翻譯。采用miR-630mimic轉染IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞,模擬細胞miR-630表達上調,觀察miR-630對TLR4表達、IgAl含量及其糖基化水平的作用,為IgA腎病發(fā)病的粘膜免疫機制提供新的理論依據(jù)。 第一章microRNA-630在IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞的表達及與IgAl低糖基化的相關性研究 目的：探索IgA腎病與非腎病扁桃體炎患者腭扁桃體組織差異表達的microRNA (miRNA),檢測腭扁桃體單個核細胞miR-630的表達,IgAl的分泌情況及其鉸鏈區(qū)糖基化水平,分析miR-630與IgAl及其糖基化水平之間的關系,預測miR-630候選靶基因。 方法：收集經腎活檢病理檢查確診為IgA腎病患者的腭扁桃體組織27例作為實驗組(IgAN組),非腎病扁桃體炎患者腭扁桃體20例作為對照組(CT組),每組患者隨機選取2例,通過Agilengt Human miRNA microarrays V19檢測IgA腎病與非腎病扁桃體炎患者腭扁桃體miRNA表達譜,分析差異表達的]miRNA,并采用qRT-PCR對部分rniRNA進行驗證。分離培養(yǎng)腭扁桃體單個核細胞,通過qRT-PCR檢測腭扁桃體單個核細胞miR-630表達,ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液IgAl含量,IgAl-蠶豆凝集素(VVL)結合實驗檢測IgAl與VVL結合力,反映IgAl鉸鏈區(qū)糖基化水平。通過Pearson相關性分析及直線回歸對腭扁桃體單個核細胞miR-630表達與IgAl含量及其低糖基化水平進行相關性分析。選取Targetscan、miRanda、 PICTA5三個常用算法對miRNA-630進行靶基因預測,為減少假陽性,記錄3個軟件的交集為miRNA-630的候選靶基因,利用DAVID數(shù)據(jù)庫對候選靶基因進行GO功能(Gene Ontology)生物過程富集(GO_BP)和信號通路分析(KEGG_PATHWAY),選擇與免疫系統(tǒng)關系密切的靶基因進行下一步實驗。 結果： 1、miRNA基因芯片鑒定結果顯示IgA腎病患者與非腎病扁桃體炎患者相比,腭扁桃體差異表達]miRNA共29個,其中表達上調miRNA7個,表達下調]miRNA22個,改變倍數(shù)2倍。qRT-PCR驗證結果顯示IgA腎病患者腭扁桃體miR-630, miR-513b, miR-135a-3p, miR-642-3p表達明顯低于與非腎病扁桃體炎患者,結果具有統(tǒng)計學意義(P0.01), miR-148-3p, miR-155-5p表達無明顯差異,驗證結果與芯片檢測結果一致。 2、IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞miR-630表達顯著低于非腎病扁桃體炎患者,結果具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。 3、IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞培養(yǎng)上清液IgAl含量較非腎病扁桃體炎患者明顯增加(p0.01),IgAl與蠶豆凝集素結合力(IgAl-VVL-binding OD值)明顯增高(p0.01),間接說明IgAl糖基化水平降低。 4、Person相關性分析及直線回歸顯示IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞miR-630表達與IgAl含量及IgAl與VVL的結合力(IgAl-VVL-binding OD值,OD值增大,間接說明IgAl糖基化水平降低)呈負相關,相關系數(shù)分別為r=-0.733,p=0.006和r=-0.697,p=0.011。 5、Targetscan、miRanda、PICTA5三種軟件對miR-630進行靶基因預測,并通過GO功能分析提示miR-630的候選靶基因與免疫系統(tǒng)相關。TLR4是miR-630的預測靶基因,TLR4的3’-UTR區(qū)有6個堿基對與miR-630的種子序列互補配對。 結論：IgA腎病患者與非腎病扁桃體炎患者腭扁桃體miRNA存在差異表達,IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞miR-630表達較非腎病扁桃體炎患者明顯降低,細胞培養(yǎng)上清液IgAl分泌增加,IgAl與蠶豆凝集素結合力(IgA1-VVL-binding OD值)增大,反應IgAl糖基化水平降低,且miR-630表達與IgAl含量及IgA1-VVL-bindingOD值負相關,提示IgA腎病患者腭扁桃miR-630表達下調可能與IgA腎病低糖基化IgAl產生相關。miR-630預測靶基因與免疫系統(tǒng)相關,TLR4是miR-630的預測靶基因,miR-630可能結合于TLR43'-UTR區(qū)降解TLR4mRNA或抑制其蛋白翻譯。 第二章TLR4在腭扁桃體的表達及miR-630對IgA腎病腭扁桃體單個核細胞TLR4及IgAl低糖基化表達的作用 目的：檢測TLR4在IgA腎病與非腎病扁桃體炎患者腭扁桃體的表達,分析TLR4與miR-630、IgAl及其糖基化水平之間的關系。采用miR-630mimic轉染IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞,模擬細胞miR-630表達上調,觀察miR-630對TLR4表達、IgAl含量及其糖基化水平的影響。 方法：免疫組織化學染色法檢測腭扁桃體TLR4表達水平,使用圖像半定量分析法對結果進行統(tǒng)計；密度梯度離心法分離腭扁桃體單個核細胞,采用qRT-PCR和Western blot技術分別檢測TLR4mRNA和蛋白表達。通過Pearson相關性分析及直線回歸對腭扁桃體單個核細胞TLR4表達與miR-630表達、IgAl水平及其低糖基化水平進行相關性分析。IgA腎病腭扁桃體單個核細胞轉染miR-630mimic,細胞培養(yǎng)72小時后,通過免疫熒光顯微鏡觀察轉染細胞形態(tài)和轉染效率,qRT-PCR、Western blot技術分別檢測轉染后TLR4mRNA和蛋白表達,ELISA檢測轉染后細胞培養(yǎng)上清液IgAl含量,IgAl-蠶豆凝集素(VVL)結合實驗檢測IgAl與VVL結合力,反映IgAl鉸鏈區(qū)糖基化水平。 結果： 1、免疫組化結果顯示IgA腎病與非腎病扁桃體炎患者腭扁桃體均表達TLR4,主要分布于扁桃體淋巴小結生發(fā)中心,IgA組TLR4表達明顯增加(p0.05)。 2、qRT-PCR及Western blot結果顯示IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞TLR4mRNA和蛋白表達較非腎病扁桃體炎患者明顯增加,結果具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。 3、Person相關性分析及直線回歸顯示IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞TLR4表達與miR-630表達呈負相關,r=-0.818,p=0.001；TLR4表達與IgAl含量及IgAl與VVL的結合力(IgA1-VVL-bindingOD值,OD值增大,間接說明IgA1糖基化水平降低)呈正相關,相關系數(shù)分別為r=0.880,p=0.000和r=0.789,p=0.002。 4、IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞轉染miR-630mimic72小時后,與陰性對照及空白對照組相比,細胞形態(tài)及細胞數(shù)目無明顯改變,轉染效率約70%。qRT-PCR檢測腭扁桃體單個核細胞轉染miR-630mimic后,miR-630表達較空白對照組升高38.7倍,結果具有統(tǒng)計學意義(p0.01),陰性對照組與空白對照組miR-630表達無明顯改變(p0.05)。 5、IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞轉染miR-630mimic72小時后,TLR4mRNA和蛋白表達水平較空白對照組明顯降低(p0.01),陰性對照組與空白對照組TLR4表達無明顯改變(p0.05)。 6、IgA腎病患者腭扁桃體單個核細胞轉染miR-630mimic72小時后,細胞培養(yǎng)上清液IgAl含量較空白對照組明顯降低(p0.01),陰性對照組與空白對照組無明顯差異；IgAl與蠶豆凝集素結合力(IgA1-VVL-binding OD值)較空白對照組降低(p0.05),說明轉染后IgAl鉸鏈區(qū)半乳糖基化水平升高,陰性對照組與空白對照組無明顯差異(p0.05)。 結論.IgA腎病患者腭扁桃體TLR4高表達,且TLR4表達與IgAl含量及IgA1-VVL-binding OD值(OD值增大,間接說明IgAl糖基化水平降低)正相關,提示TLR4與低糖基化IgAl產生相關。miR-630是TLR4的負性調節(jié)因子,miR-630可抑制TLR4表達,減少低糖基化IgAl產生。IgA腎病患者腭扁桃體miR-630表達下調可能參與腭扁桃體IgAl產生及其鉸鏈區(qū)低糖基化,機制可能由于miR-630表達下調導致對TLR4的抑制作用降低有關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R692.31

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 門曉光,唐增福;14例腭扁桃體非霍奇金氏淋巴瘤的臨床分析[J];耳鼻咽喉頭頸外科;2001年06期

2 程心建;;等離子治療腭扁桃體炎60例[J];西部醫(yī)學;2007年06期

3 曲成晶;谷京城;崔穎;劉永新;類延華;劉宏偉;;人腭扁桃體正常及病理情況下體積、密度的臨床檢測與評價[J];實用醫(yī)學雜志;2008年06期

4 閔密克;陳麗華;金伯泉;馬超武;甘新飛;周宇;寶慶付;;腭扁桃體中幾種殺傷功能相關分子的表達[J];臨床軍醫(yī)雜志;2010年05期

5 張子騰;黃會龍;常驍;龔杰;劉鎮(zhèn);郭曉丹;吳愛群;;腭扁桃體動脈的解剖特點及與腭扁桃體術后嚴重出血的關系探討[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2011年24期

6 李彥;;腭扁桃體濾泡樹突狀細胞肉瘤1例[J];人民軍醫(yī);2012年11期

7 盧世博;王翠玉;吉奰;;懸垂的腭扁桃體二例報告[J];遼寧醫(yī)學雜志;1965年02期

8 盧效廉;;腭扁桃體手術時一種麻醉方法[J];山西醫(yī)學雜志;1966年01期

9 阮盛祥;;腭扁桃體淋巴管瘤[J];國外醫(yī)學參考資料.耳鼻咽喉科學分冊;1978年02期

10 彭子成;;腭扁桃體狀態(tài)的免疫形態(tài)學評價[J];國外醫(yī)學.耳鼻咽喉科學分冊;1984年06期

相關會議論文 前5條

1 陳建強;鄒建定;熊華;魯杰;;兒童阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征的微創(chuàng)治療[A];浙江省中西醫(yī)結合學會耳鼻咽喉科專業(yè)委員會第六次學術年會暨省級繼續(xù)教育學習班資料匯編[C];2008年

2 張子騰;黃會龍;劉鎮(zhèn);龔杰;郭曉丹;吳愛群;;面動脈腭扁桃體支的應用解剖及其臨床意義[A];中國解剖學會2011年年會論文文摘匯編[C];2011年

3 胡蓉;蘇敏;李紅;姜俸蓉;許庭良;;人胎腭扁桃體的組織發(fā)生及及相關T、B細胞的發(fā)育[A];2007年中國解剖學會第十屆全國組織學與胚胎學青年學術研討會論文摘要匯編[C];2007年

4 田英;馬婕;趙麗;;睡眠呼吸暫停綜合征的監(jiān)護與護理[A];全國口腔科護理學術交流暨專題講座會議論文匯編[C];2002年

5 何晚紅;王雯慧;關飛;臺立峰;許小紅;扎西英派;高強;祁珊珊;楊垎程;;雙峰駝腭扁桃體的解剖學特征與其年齡之間的相關性研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分會第十六次學術研討會、中國病理生理學會動物病理生理專業(yè)委員會第十五次學術研討會論文集[C];2009年

相關重要報紙文章 前1條

1 本報記者 尹慧文 通訊員 王玉林;護佑生命之源[N];大眾衛(wèi)生報;2013年

相關博士學位論文 前1條

1 賀理宇;IL-4/STAT6、HIPK2對IgA腎病人腭扁桃體低糖基化IgA1表達的調控機制研究[D];中南大學;2013年

相關碩士學位論文 前1條

1 楊淡f3;腭扁桃體摘除聯(lián)合藥物治療IgA腎病223例長期療效研究[D];中南大學;2012年

，

本文編號：1992955