本文選題：微小RNA-630 + 腎透明細胞癌��； 參考：《河北醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：腎細胞癌(RCC)目前占大約每年所有新發(fā)成人惡性腫瘤的3%,而且其發(fā)病率在過去的二十年中一直呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。因此,為了更好的控制腫瘤、治療患者,研究者需要找到更加理想的特異性靶點,對腫瘤進行有效的治療。新的靶點不僅能夠?qū)δ[瘤進行早期診斷,也能有助于對腫瘤更早的進行干預和治療。在關(guān)于腎癌的病理研究表明,90%的患者為腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,CCRCC)或者乳頭狀腎癌(papillary renal cell carcinoma,PRCC)。腎透明細胞癌作為最為重要的腎癌類型之一,對其進行深入的研究分析顯得十分重要。microRNA(miRNA)是小的非編碼RNA,在調(diào)節(jié)基因表達中發(fā)揮重要作用,并參與各種細胞的生物學過程,包括癌癥的發(fā)生發(fā)展。幾項關(guān)于腎細胞癌的研究都發(fā)現(xiàn),micro RNA表達在腎癌的發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用,而且與腫瘤預后具有明顯的關(guān)系。mi R-630是近年來新發(fā)現(xiàn)的microRNA之一,在許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了其表達上調(diào)。但是miR-630是否在腎癌組織中存在表達,以及其表達是否與腎癌細胞的生物學行為有關(guān)系,是否與腎癌的臨床分期、腫瘤預后存在相關(guān)性,還不得而知。第一部分miR-630在腎透明細胞癌組織中表達及其與臨床病理相關(guān)性的研究目的:通過分析腎透明細胞癌組織中mi R-630的表達水平與患者臨床分期、腫瘤分級和預后的關(guān)系,探討mi R-630在腎透明細胞癌生物學行為中發(fā)揮的作用。方法:實時定量熒光PCR法檢測腎透明細胞癌組織中miR-630的表達,分析其與患者臨床生物學行為的關(guān)系:1 HE染色法確認實驗納入標準:診斷為腎細胞癌,未接受任何輔助治療。腎癌根治性切除術(shù)后腎癌組織標本及癌旁腎組織標本,經(jīng)HE染色后組織形態(tài)學觀察確認為腎透明細胞癌及切緣陰性的非癌組織。2實時定量熒光PCR法檢測miR-630表達水平:設(shè)計針對miR-630的特異性引物,通過實時定量熒光pcr方法,檢測實驗組織中的mir-630表達水平。3mir-630表達水平與患者臨床病理參數(shù)及預后的關(guān)系:mir-630表達水平與腎透明細胞癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用mann whitneyu和kruskal wallis檢驗,mir-630表達水平與患者預后之間的關(guān)系采用kaplan meier進行檢驗,采用cox法進行多參數(shù)的回歸性分析,本研究采用cox比例風險回歸分析模型(coxproportionalhazardsmodel),此方法適用于當自變量為兩個以上或者自變量為連續(xù)變量的情況。結(jié)果:1腎透明細胞癌組織和癌旁組織中提取細胞總rna,并檢測后確認提取的rna的a260/280的od值的比值均在2左右,實時定量熒光pcr檢測結(jié)果顯示:癌組織中mir-630表達水平為7.36±1.27;癌旁組織中mir-630表達水平為2.86±0.57。統(tǒng)計學分析結(jié)果表明,癌組織的mir-630表達水平明顯高于相應(yīng)的癌旁組織(p0.05)。2高腫瘤病理分級的患者(iii-iv級)mir-630表達水平明顯高于低腫瘤病理分級(i-ii級)患者(p=0.001);淋巴轉(zhuǎn)移陽性的患者腎癌組織中mir-630表達水平明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者的mir-630表達水平(p=0.015);存在遠處轉(zhuǎn)移患者的腎癌組織mir-630表達水平明顯高于遠處轉(zhuǎn)移為陰性的患者(p=0.004)。但是研究分析也發(fā)現(xiàn),高臨床病理分期患者(t3-t4)的mir-630水平與低臨床病理分期患者(t1-t2)相比,二者之間并沒有明顯差別(p=0.717)。此外在不同性別、年齡段相比,mir-630表達水平也沒有明顯差別。3采用kaplan-meier方法,單變量生存分析研究結(jié)果表明,患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(rr=5.108,p=0.015)、腫瘤遠處轉(zhuǎn)移陽性情況(rr=5.979,p=0.004)、腫瘤病理分級(rr=3.264,p0.001)與患者術(shù)后預后生存有明顯的相關(guān)性。而且,mir-630表達與患者預后具有明顯相關(guān)性(rr=3.378,p=0.008)。4患者術(shù)后生存曲線與腎癌組織的mir-630表達水平分析表明:mir-630為腎透明細胞癌的預后獨立危險因素(rr=3.021,ci=2.074-5.726,p=0.016)。患者的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(rr=3.681,ci=2.171-4.472,p=0.031)、病理分級(rr=2.781,ci=1.876-4.638,p=0.006)及腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移(rr=3.936,ci=2.074-5.726,p=0.016)同樣為患者術(shù)后生存的獨立危險因素。第二部分腎癌細胞系及腎小管上皮細胞中mir-630表達水平的檢測目的:比較mir-630在腎癌細胞中與正常腎小管細胞中的表達水平,分析mir-630在各個不同腎癌細胞系中是否存在表達差異。方法:分別體外培養(yǎng)腎癌細胞系786-o,achn,caki-1和caki-2,以及正常腎近端小管上皮細胞系hk-2。通過實時定量熒光pcr技術(shù),檢測各個細胞系中的mir-630表達水平。結(jié)果:分別提取正常腎近曲小管細胞系hk-2和腎癌細胞系786-o,achn,caki-1和caki-2的細胞內(nèi)總rna,然后反轉(zhuǎn)錄為cdna。采用人特異性的mir-630引物,應(yīng)用實時熒光定量pcr檢測后發(fā)現(xiàn),腎癌細胞系中的mir-630表達水平均高于正常腎小管上皮細胞系hk-2的mir-630表達水平(p0.05),但是不同的腎細胞癌細胞系(786-o,achn,caki-1和caki-2)之間,mir-630表達水平未見明顯差異(p0.05)。第三部分抑制mir-630對腎癌786-o細胞生長、侵襲和凋亡的影響目的:通過腎癌細胞系的體外實驗,進一步分析和證實mir-630對腎癌細胞生長、侵襲和凋亡方面的影響。方法:1mtt法檢測細胞生長:體外培養(yǎng)腎癌細胞系786-o,然后用mir-630的anti-mir-630轉(zhuǎn)染786-o細胞,并采用陰性sirna轉(zhuǎn)染的細胞作為對照。轉(zhuǎn)染96小時后,采用mtt法測定轉(zhuǎn)染細胞的生長曲線,陰性轉(zhuǎn)染的細胞作為對照。2流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡:腎癌細胞系786-o轉(zhuǎn)染anti-mir-630,同樣陰性轉(zhuǎn)染作為對照,轉(zhuǎn)染48小時后,收集細胞,采用annexinv-egfp和propidiumiodide染色,染色后采用流式細胞儀進行分析,檢測細胞凋亡情況。3細胞劃痕實驗:腎癌細胞系786-o轉(zhuǎn)染mir-630的anti-mir-630抑制其表達,然后將細胞種植于培養(yǎng)板內(nèi),待細胞長滿后,進行劃痕,然后每天觀察細胞生長遷移情況,以評估m(xù)ir-630表達陽性和mir-630表達抑制的癌細胞遷移差別的情況。4細胞侵襲性分析:腎癌細胞系786-o轉(zhuǎn)染anti-mir-630抑制mir-630表達后,將細胞置于transwell小室上層,繼續(xù)培養(yǎng)48小時后,顯微鏡下觀察穿過小室的細胞數(shù),并將轉(zhuǎn)染陰性對照sirna的腎癌細胞作為對照,分析細胞的侵襲能力和mir-630對細胞侵襲行為的影響。結(jié)果:腎癌細胞786-o轉(zhuǎn)染抑制mir-630表達anti-mir-630后,實時熒光定量pcr檢測結(jié)果表明,細胞內(nèi)的mir-630表達水平明顯低于轉(zhuǎn)染陰性對照sirna的細胞;進一步體外實驗結(jié)果顯示:1細胞生長情況:轉(zhuǎn)染mir-630抑制anti-mir-630的786-o細胞的生長明顯小于只做陰性轉(zhuǎn)染的細胞,二者之間差別具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。2細胞遷移情況:采用細胞劃痕實驗分析mir-630對786-o細胞的遷移作用,研究發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染mir-630的anti-mir-630后,細胞內(nèi)的mir-630表達明顯受到了抑制,細胞48小時的遷移情況分析則表明,在mir-630受到抑制后,786-o細胞遷移率明顯下降,表明mir-630對細胞遷移具有促進作用。3細胞侵襲情況:采用transwell小室對腎癌786-o細胞的侵襲性進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)mir-630表達受到抑制的實驗組的遷移的細胞明顯少于陰性對照組(p0.05),mir-630表達下調(diào)后,細胞侵襲性相應(yīng)下降。4細胞凋亡檢測:對腎癌786-o細胞的凋亡相關(guān)蛋白進行染色,然后采用流式細胞儀凋亡技術(shù)檢測分析后發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染mir-630的anti-mir-630的786-o細胞的凋亡率明顯高于陰性對照組的786-o細胞(p0.05)。第四部分腎透明細胞癌mir-630靶基因預測、篩選與驗證目的:預測mir-630的靶基因,并從中篩查與腎癌有關(guān)的基因為目的基因,并初步探討其功能。方法:1利用生物信息軟件預測mir-630的靶基因,結(jié)果進行keggpathway富集分析,結(jié)合靶基因在生物信息軟件中的分值進行篩選。2利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)在腎癌細胞786-o細胞中建立mir-630過表達及抑制表達模型。3利用實時定量pcr技術(shù)和western-blot及fcm技術(shù)檢測細胞模型中的mir-630與靶基因的表達水平的相關(guān)性及其功能。結(jié)果:1使用常用數(shù)據(jù)庫對靶基因進行預測,并通過實時定量pcr檢測篩選靶基因,發(fā)現(xiàn)mir-630mimics作用后,其中rasgrf1、cdc14a兩個基因有明顯的下降,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01);mir-630inhibitor作用后升高,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。2western-blot檢測細胞轉(zhuǎn)染后rasgrf1、cdc14a的蛋白表達,顯示轉(zhuǎn)染了mir-630mimics的786-o細胞中的rasgrf1與cdc14a蛋白表達量較陰性對照組、空白對照組顯著下降,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01);轉(zhuǎn)染了mir-630inhibitor的786-o細胞中的rasgrf1與cdc14a蛋白的表達量較陰性對照組和空白對照組升高,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。3流式檢測mir-630和anti-mir-630組細胞周期變化,結(jié)果顯示,mir-630mimics組g1期明顯縮短,而g2、s期明顯延長;mir-630mimicsinhibitor組g1期明顯延長,而g2、s期明顯縮短,因此表明轉(zhuǎn)染mir-630mimicsinhibitor后細胞出現(xiàn)了g1期阻滯。結(jié)論:1腎透明細胞癌中mir-630的表達較癌旁組織明顯升高,提示mir-630在腎透明細胞癌的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。2腎透明細胞癌組織內(nèi)mir-630表達水平與病理組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移灶有明顯的相關(guān)性,因此推測mir-630與腎透明細胞癌的惡性程度及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān);mir-630高表達的腎透明細胞癌患者預后差,生存期更短,因此推測mir-630可能促進了腎透明細胞癌的惡性進展。3mir-630表達上調(diào)可能是腎細胞癌的一個常見現(xiàn)象,因此表明mir-630可能是腎癌的重要標志物之一;不同的腎癌細胞系mir-630表達水平?jīng)]有明顯差別,因此推測mir-630可能在腎癌細胞的一些基本的生物學行為中發(fā)揮重要作用。4mir-630高表達能夠促進腎透明細胞癌細胞生長、抑制其凋亡、促進癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移,因此本研究認為mir-630是導致腎透明細胞癌進展的重要因素之一;anti-mir-630能夠明顯降低腎透明細胞癌mir-630表達水平,進而導致細胞凋亡、生長減慢、侵襲能力下降,因此推測mir-630可能是腎透明細胞癌的潛在的治療靶點之一。5證實mi R-630和RASGRF1、CDC14A的靶向關(guān)系為明確腎透明細胞癌發(fā)病機制提供了新的理論依據(jù),開拓了新的思路;mi R-630的表達量與RASGRF1和CDC14A蛋白的表達水平存在有負性關(guān)系;miR-630可能對RASGRF1、CDC14A具有負性調(diào)控作用,此作用關(guān)系進一步影響到腎透明細胞癌的細胞周期變化。綜上所述,mi R-630在腎癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用,而且在作為腎癌的早期診斷的分子標志物,以及潛在的分子靶向治療的靶標方面均具有非常重要的價值。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.11

【共引文獻】

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本文編號：1988207