本文選題：基質金屬蛋白酶-12 + 糖尿病腎病��； 參考：《河北醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：隨著世界經濟的飛速發(fā)展和人們生活水平的普遍升高,飲食結構中高糖、高脂成分所占比率逐年提高,致使人類糖尿病及高脂血癥的發(fā)病率逐年增加。我國作為世界上最大的糖尿病流行地,超過1.3億的糖尿病患者給社會和家庭帶來沉重的負擔,糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)作為糖尿病患者主要微血管并發(fā)癥之一,已經成為終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)的重要病因,與糖尿病患者的死亡率密切相關。同時脂代謝紊亂如高脂血癥,也是糖尿病腎病的重要危險因素,增高的血脂可以直接沉積在腎臟中造成腎小球內皮細胞、系膜細胞等損傷,加重腎小球硬化。因此糖尿病腎病以及高脂血癥伴隨血糖升高、血脂異�？梢鹨幌盗心I臟病理改變,包括細胞外基質(extracellular matrix,ECM)聚集、氧化應激、炎細胞浸潤等,加重腎臟纖維化(renal fibrosis)。腎臟纖維化又是所有慢性腎病(chronic kidney disease,CKD)發(fā)展至終末期腎臟病的共同通路。目前認為腎臟纖維化是一個類似于損傷的愈合反應過程。在炎癥損傷反應過程中,腎臟內出現(xiàn)單核細胞/巨噬細胞浸潤和T細胞激活,活性氧(reactive oxygen species,ROS)產生增多,炎細胞及促炎細胞趨化因子分泌增加,上述病理改變又通過激活腎臟系膜細胞、成纖維細胞和腎小管上皮細胞分泌大量的ECM組分,逐漸加重腎臟纖維化,最終發(fā)展至終末期腎衰竭,而使正常腎功能永久喪失�；|金屬蛋白酶-12(matrix metalloproteinase-12,MMP-12),又稱為巨噬細胞金屬蛋白酶,最早是在巨噬細胞內發(fā)現(xiàn)的一種能夠降解彈性蛋白(elastin)的金屬蛋白酶。研究表明,MMP-12不僅可以降解其主要底物-彈性蛋白,而且同樣可以降解其它一些ECM組分,如IV型膠原、纖維連接蛋白(fibronectin,FN)、層粘連蛋白(laminin,LN)、Vitronectin、蛋白多糖、硫酸軟骨素和髓磷脂堿性蛋白等。目前已知MMP-12可在肥厚性破骨細胞、血管平滑肌細胞、活化的腎系膜細胞和一些癌癥細胞表達。MMP-12表達異常與腹主動脈瘤、動脈粥樣硬化和肺氣腫等疾病密切相關,但是MMP-12的表達對于糖尿病腎病和高脂腎損傷中所產生的相關病理機制還鮮有報道。目的:通過對體外培養(yǎng)的糖尿病大鼠腎小球系膜細胞以及DN、高脂腎損傷動物模型進行研究,觀察MMP-12基因表達缺失在DN和高脂腎損傷中細胞外基質、氧化應激、炎細胞浸潤等方面發(fā)揮的腎保護作用及其機制。方法:本研究利用體外培養(yǎng)的SD大鼠腎小球系膜細胞(glomerular mesangial cell,GMC),觀察高糖對GMC中MMP-12基因、大鼠GMC中ECM和氧化應激相關基因和蛋白表達的影響,并通過si RNA敲低MMP-12基因的表達,觀察MMP-12基因表達降低后對與腎臟纖維化密切相關的TGF-b1信號途徑的影響。為闡明MMP-12的在DN中的相關機制,利用MMP-12基因敲除小鼠構建鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘導的糖尿病腎病動物模型,探討MMP-12基因表達缺失在DN中的腎保護作用。利用載脂蛋白E(apolipoprotein E,apo E)和MMP-12雙基因敲除小鼠構建高脂飲食(high fat diet,HFD)誘導的小鼠高脂腎損傷動物模型,探討MMP-12基因表達缺失在高脂腎損傷中的腎保護作用。并同時應用熒光實時定量反轉錄PCR(Real Time-q PCR)、Western blot檢測ECM、氧化應激和炎細胞浸潤相關基因m RNA及蛋白質表達變化;應用免疫熒光染色確定相關蛋白的相互作用;應用免疫組化染色觀察腎臟組織中ECM聚集、氧化應激、炎細胞浸潤這三方面病理改變,最終闡明MMP-12基因表達缺失在糖尿病腎病小鼠模型和HFD誘導腎損傷小鼠動物模型中發(fā)揮的腎保護作用及其機制。結果:1 MMP-12對高糖誘導的大鼠GMC中ECM表達和氧化應激的影響1.1 SD大鼠腎小球系膜細胞分離和培養(yǎng):SD大鼠GMC體外傳代培養(yǎng)后分為三組,即正常對照組(D-葡萄糖5.5mmol/L,NG組)、甘露醇組(甘露醇25mmol/L,MG組)、高糖組(D-葡萄糖30 mmol/L,HG組)。分別于處理后的不同時間點收集細胞,提取蛋白和總RNA,Western blot和Real Time-q PCR分析MMP-2、MMP-9、MMP-12、TGF-b、FN、LN等主要的ECM、氧化應激相關基因和蛋白表達的變化;通過si RNA敲低MMP-12基因的表達觀察其對腎臟纖維化密切相關的TGF-b1信號途徑的影響。1.2高糖誘導SD大鼠腎小球GMC上調ECM相關基因的表達:Real time q PCR的結果表明,與NG組相比,HG處理后GMC中的MMP-2、MMP-9、MMP-12、FN和LN基因的表達均上調,其中MMP-2、MMP-9、FN和LN基因的表達于6-12 h開始升高,呈時間依賴性,MMP-2到48 h時達到峰值,72 h后表達略有下降,但仍高于NG組和MG組其他各時間觀察點(P0.05);MMP-9到24 h時達到峰值,48h、72 h后表達略有下降,但仍高于NG組和MG組其他各時間觀察點(P0.05);FN和LN到72 h時達到峰值;而MMP-12基因的表達于6 h開始升高,呈時間依賴性,到12 h時達到峰值(P0.05),一直持續(xù)高表達至48h,72 h后表達略有下降,但仍高于NG組和MG組其他各時間觀察點(P0.05)。1.3高糖誘導GMC上調氧化應激相關蛋白的表達:Western blot結果顯示,高糖能夠誘導GMC表達不同類型的NADPH氧化酶(Nox),與NG組相比,HG處理后Nox2、Nox4以及亞基p67phox和p22phox的表達在48 h后達到峰值,72 h后其表達仍然高于同一時間點NG組和MG組細胞(P0.05)。1.4敲低MMP-12基因的表達顯著抑制TGF-b1的信號途徑:Western blot結果顯示,GMC經HG刺激后不僅顯著上調TGF-b1的表達,而且促使TGF-b1(4 ng/m L,10 min)誘導的ERK1/2和Akt磷酸化增強。而si RNA敲低GMC中MMP-12基因的表達,則能夠顯著抑制HG上調的TGF-b1表達及其增強ERK1/2和Akt磷酸化的作用。2 MMP-12基因表達缺失在糖尿病腎病小鼠模型中發(fā)揮腎保護作用2.1 WT組小鼠和MMP-12-/-組小鼠生化指標和腎功能指標的變化:MMP-12基因敲除小鼠和相同遺傳背景的C57BL/6J(WT)小鼠腹腔一次性注射STZ(175 mg/kg)制備DN動物模型,造模成功后八周檢測小鼠生化指標和腎功能指標的變化。WT組小鼠和MMP-12-/-組小鼠無論是對照組(NC)還是糖尿病腎病組(DN)體重和血壓無顯著差異,但是DN組的血糖水平顯著高于NC組(WT組,DN小鼠288.4±14.3 vs NC 128.6±13.6,P0.05;MMP-12-/-組,DN小鼠245.3±11.7 vs NC 134.9±14.1,P0.05),該結果表明,MMP-12基因敲除能夠顯著抑制STZ誘導血糖升高(MMP-12-/-組,DN 245.3±11.7 vs WT DN 288.4±14.3,P0.05)。DN組同NC組相比,24小時尿白蛋白排泄(albumin excretion,mg/24 h)、血肌酐(SCR)和尿素氮(BUN)顯著升高(P0.05),表明此時糖尿病腎臟病變加重,腎功能受損,但是MMP-12-/-組中DN小鼠同WT組中DN小鼠相比,24小時尿白蛋白排泄、SCR和BUN水平有顯著降低,表明MMP-12表達缺失能夠部分逆轉STZ誘導的腎損傷,對DN產生一定的腎保護作用。2.2 MMP-12的表達與腎損傷程度密切相關:PAS染色結果表明,STZ誘導8周后,WT組中DN小鼠腎小球體積顯著增大、系膜基質增多、基底膜增厚。MMP-12-/-組中DN小鼠同WT組DN小鼠相比,腎臟病變程度明顯減弱。同時免疫組化染色結果顯示,WT組中DN小鼠腎小球部位MMP-12陽性染色顆粒明顯增多,表明MMP-12的表達和腎小球病變程度具有正相關性。2.3 MMP-12缺失抑制STZ誘導腎小球細胞外基質聚集和促炎相關基因的表達:Real time q PCR結果顯示,MMP-12-/-組DN小鼠腎組織中MMP-12、MMP-2和MMP-9基因的轉錄水平較WT組DN小鼠表達顯著降低;MMP-12-/-組DN小鼠腎組織中TGF-b1及其下游FN和LN等纖維化相關基因表達均較WT組的DN小鼠顯著下調;MMP-12基因缺失同時抑制了腎小球單核細胞/巨噬細胞標記分子單核細胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)和CD11b的表達。2.4 MMP-12缺失逆轉在腎小球STZ誘導的巨噬細胞浸潤:免疫組化結果表明,與WT組NC小鼠相比,WT組DN小鼠腎小球區(qū)域能檢測到較強的CD68陽性染色顆粒,而在MMP-12-/-組DN小鼠腎小球中CD68的表達卻顯著低于WT組DN小鼠,Real time q PCR結果也同時證實了CD68轉錄水平和蛋白水平具有相同的變化趨勢。2.5 MMP-12缺失抑制STZ誘導的腎小球氧化應激:Western blot結果表明WT組中,STZ誘導DN小鼠腎小球中Nox4和p67phox表達顯著增加,而MMP-12表達缺失能夠顯著降低腎小球中Nox4和p67phox的表達。STZ的誘導作用通常是通過激活上游的MCP-1和TGF-b的表達來完成的。同WT組對照小鼠相比,STZ誘導WT組DN小鼠腎小球中MCP-1和TGF-b的表達及其下游信號分子ERK1/2和Akt的磷酸化顯著增加,而MMP-12表達缺失能夠逆轉STZ對這兩種促氧化應激蛋白的表達和下游信號分子的磷酸化的促進作用。3 MMP-12基因表達缺失在高脂腎損傷小鼠模型中發(fā)揮腎保護作用3.1 MMP-12缺失逆轉HFD誘導的腎損傷:HFD飼養(yǎng)apo E-/-和apo E-/-MMP-12-/-小鼠不同時間點后生化指標顯示,apo E-/-和apo E-/-MMP-12-/-小鼠的體重、血壓、總膽固醇、甘油三酯、HDL和LDL水平在各組無明顯差異。同正常飲食小鼠相比,反映腎功能指標的24小時尿蛋白定量和血清肌酐濃度在HFD后第6和第9個月顯著增高,但是apo E-/-MMP-12-/-小鼠HFD組這兩個指標顯著低于同時間點HFD組的apo E-/-相小鼠,該結果表明MMP-12缺失能夠部分逆轉HFD誘導的腎臟損傷。3.2 HFD誘導腎小球MMP-12的表達:免疫組化和Real-time q PCR結果顯示,在HFD誘導的apo E-/-小鼠中,MMP-12陽性染色顆粒隨HFD處理時間的延長呈持續(xù)增多的趨勢;腎小球MMP-12 m RNA水平通過q RT-PCR進行分析,結果顯示了相同的變化趨勢。3.3 MMP-12缺失抑制HFD誘導的腎小球胞外基質聚集和促炎相關基因的表達:免疫組化和Real-time q PCR技術顯示,HFD能夠誘導apo E-/-小鼠FN和IV型膠原在腎組織的持續(xù)表達,而MMP-12缺失則可逆轉HFD誘導的FN和IV型膠原的表達上調過程;Real-time q PCR結果表明,HFD處理3個月后apo E-/-小鼠腎臟纖維化標記基因TGF-β1,炎癥相關基因MCP-1和CD11b的m RNA水平顯著增加,而apo E-/-MMP-12-/-小鼠腎小球中這兩類基因的m RNA水平顯著低于同時間點的apo E-/-小鼠;3.4 MMP-12缺失逆轉HFD誘導的巨噬細胞在腎小球的募集和浸潤:免疫組化和Real-time q PCR結果顯示,apo E-/-小鼠腎小球巨噬細胞募集和浸潤在HFD處理后3、6、9個月持續(xù)表達增強,而MMP-12缺失可以抑制HFD誘導的巨噬細胞在腎小球的募集和浸潤。3D膠細胞體外侵染實驗進一步表明,MMP-12缺失能夠拮抗或抑制HFD誘導的巨噬細胞募集和浸潤過程。免疫熒光染色后應用激光共聚焦顯微鏡觀察,結果顯示腎小球MMP-12是由募集和浸潤的巨噬細胞分泌或是由損傷導致的活化系膜細胞分泌。3.5 MMP-12缺失抑制HFD誘導的腎小球氧化應激過程:Western blot結果顯示HFD能夠誘導apo E-/-小鼠Nox4和p67phox的持續(xù)表達,而MMP-12缺失則逆轉HFD誘導的Nox4和p67phox的表達上調過程。對其信號途徑的研究表明,HFD誘導的apo E-/-小鼠腎小球中ERK1/2和Akt的磷酸化水平在3-6個月時顯著增強,但這種影響可在MMP-12表達缺失時而被顯著抑制。結論:1高糖可以誘導腎小球系膜細胞中MMP-12、細胞外基質組分、促炎因子及氧化應激等相關基因的表達上調;2敲低MMP-12基因的表達顯著抑制與腎臟纖維化密切相關的TGF-?1的信號途徑;3 MMP-12基因表達缺失可以通過降低FN、LN、IV型膠原減少細胞外基質聚集,通過減少NADPH氧化酶表達抑制氧化應激,通過降低促炎因子表達抑制炎細胞浸潤,進而在STZ誘導的糖尿病腎損傷小鼠動物模型及HFD誘導的高脂腎損傷小鼠動物模型中發(fā)揮腎保護作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R692.9

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 張順興,陳向東,卜強,顧斌,張克賢;小兒腎損傷的診斷和治療[J];江蘇醫(yī)藥;2000年06期

2 邱建新,鄒煉,趙致廣;腎損傷167例診治體會[J];中華泌尿外科雜志;2000年02期

3 陳久華,陳立中;腎損傷32例診治分析[J];廣東醫(yī)學院學報;2000年03期

4 李偉邦;腎損傷的診斷和治療[J];華夏醫(yī)學;2000年03期

5 王若天,王安;腎損傷52例診治分析[J];海南醫(yī)學;2000年02期

6 程良敖,成志緒;腎損傷39例診治體會[J];淮海醫(yī)藥;2000年01期

7 杜喜民,李樹,薛偉;腎損傷137例臨床分析[J];黑龍江醫(yī)學;2000年10期

8 楊峰,李靖,邱必修;小兒腎損傷27例診治體會[J];洛陽醫(yī)專學報;2000年02期

9 田玉林,邱瑩;腎損傷診斷及治療(附58例報告)[J];華北煤炭醫(yī)學院學報;2000年03期

10 陳建中,裴繼云,李平,李景勤,張金平,鄧軍,孫發(fā)林,劉毅;腎損傷136例診治體會[J];人民軍醫(yī);2000年03期

相關會議論文 前10條

1 姜睿;李洪位;姚家福;;32例交通事故后腎損傷的臨床分析[A];第三屆全國急診創(chuàng)傷學學術交流會論文匯編[C];1999年

2 張末成;;腎損傷診治體會(附107例報告)[A];第十五屆全國泌尿外科學術會議論文集[C];2008年

3 劉樹聲;吳永吉;王立明;甄景波;夏溟;;100例腎損傷診治體會[A];第十五屆全國泌尿外科學術會議論文集[C];2008年

4 彭偉;;腎損傷的診治體會總結(附116例報告)[A];第十五屆全國泌尿外科學術會議論文集[C];2008年

5 周本初;盧國軍;陳凌燕;黃靜波;;251例腎損傷的診治報告[A];華東六省一市泌尿外科學術年會暨2011年浙江省泌尿外科、男科學學術年會論文匯編[C];2011年

6 桂定文;張青漢;夏焱森;葉緒龍;董能本;潘衛(wèi)兵;彭偉;姜衛(wèi)東;陳小剛;;86例外傷性腎損傷的診治總結[A];第七次中國中西醫(yī)結合泌尿外科學術年會暨第二次廣東省中西醫(yī)結合泌尿外科學術年會論文集[C];2009年

7 梁學儉;;一種預防腎損傷的新型抗氧化療法[A];全國第二屆中醫(yī)中西醫(yī)結合腎臟病臨床進展學術研討會論文集[C];2007年

8 王鋒;邢濤;汪年松;黃雅娟;;妊娠相關腎損傷的臨床調查[A];第十一屆全國中西醫(yī)結合腎臟病學術會議論文匯編[C];2010年

9 郝軍;張煥然;張歌;;三十例腎損傷臨床診治的總結[A];第三屆全國急診創(chuàng)傷學學術交流會論文匯編[C];1999年

10 楊桂芳;劉丹松;;腎損傷診治12例體會[A];2000年全國危重病急救醫(yī)學學術會議論文集[C];2000年

相關重要報紙文章 前5條

1 記者 衣曉峰;三聚氰胺所致腎損傷或可自行恢復[N];健康報;2012年

2 本報記者 姜恒;易致腎損傷的藥物[N];中國醫(yī)藥報;2014年

3 鄭楊;亂吃偏方、感冒藥，小心吃出肝腎損傷[N];中國婦女報;2013年

4 河南省洛陽正骨醫(yī)院 張虹;中藥引起腎損傷的幾種常見原因[N];中國中醫(yī)藥報;2008年

5 王安蘭;拍打孩子有隱患[N];衛(wèi)生與生活報;2003年

相關博士學位論文 前10條

1 牛洪琳;基質金屬蛋白酶12表達對糖尿病腎病及高脂腎損傷的腎保護作用及其機制的研究[D];河北醫(yī)科大學;2016年

2 宋蓮蓮;腎損傷分子-1表達在移植腎損傷中的變化和意義[D];吉林大學;2014年

3 孫立;早期診斷結核桿菌相關腎損傷的實驗性研究[D];中國醫(yī)科大學;2010年

4 劉曄;缺血再灌注腎損傷的代謝組學及飽和氫生理鹽水對其保護作用的研究[D];第二軍醫(yī)大學;2011年

5 彭建平;高糖對急性缺血性腎損傷敏感性的影響及機制探討[D];武漢大學;2012年

6 孫雪峰;Prohibitin的組蛋白乙�；揎椊閷c大霉素誘導腎損傷的機制研究[D];吉林大學;2014年

7 林喜秀;力竭運動致大鼠慢性腎損傷機制及促紅細胞生成素干預研究[D];湖南師范大學;2011年

8 王文紅;SPECT與MSCT評價L-NAME致兔高血壓性腎損傷的實驗研究[D];天津醫(yī)科大學;2011年

9 符彥基;骨形成蛋白-7基因修飾的骨髓間充質干細胞對腎缺血再灌注損傷修復作用的實驗研究[D];南昌大學;2008年

10 徐長庚;Lefty1抗積水腎損傷及其機制研究[D];武漢大學;2014年

相關碩士學位論文 前10條

1 張寧;在卡鉑所致的大鼠急性腎損傷中腎損傷分子-1的表達及鹽酸乙酰左卡尼汀對其保護作用的研究[D];河北聯(lián)合大學;2014年

2 高爽;血栓性微血管病患者腎動脈阻力指數與腎功能的相關性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

3 賈德升;ESWL前后腎損傷生化指標變化的臨床研究[D];寧夏醫(yī)科大學;2015年

4 張雯;腎損傷時MPP5與鉀離子波動及炎癥因子的相關變化分析[D];南京中醫(yī)藥大學;2015年

5 彭忠將;氫氣對小鼠草酸鈣結晶腎損傷的保護作用和代謝組學研究[D];第二軍醫(yī)大學;2015年

6 高松燕;基于兩種動物模型的結晶腎損傷形成機制及中藥干預的代謝組學研究[D];第二軍醫(yī)大學;2015年

7 曹香華;有機溶劑腎損傷的表觀遺傳機制研究[D];南京大學;2015年

8 李進沛;胸腰椎骨折與腎損傷的相關性及早期尿隱血檢測的臨床意義研究[D];山東大學;2015年

9 高標;硫化氫治療肥胖性腎損傷的分子機制[D];河南大學;2015年

10 王娟;中西醫(yī)結合階梯治療方案降低HSP腎損傷發(fā)生率及尿EGF、血清VEGF機制研究[D];河南中醫(yī)學院;2015年

，

本文編號：1971147