本文選題：藤黃酸 + 轉(zhuǎn)移性激素抵抗性前列腺癌�。� 參考：《北京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：目的:探索藤黃酸(Gambogic acid,GA)抗轉(zhuǎn)移性激素抵抗性前列腺癌(castrate resistant prostate cancer,CRPC)的活性及其作用機(jī)制。方法:為了探索和明確藤黃酸在轉(zhuǎn)移性激素抵抗性前列腺癌中的作用及機(jī)制,我們以基因工程小鼠(PbCre4;Ptenfl/flTp53tfl/fl)的前列腺癌細(xì)胞(prostate cancer adenocarcinomaPten/Tp53null,PCAPs)和來源于不同遺傳背景的轉(zhuǎn)移性CRPC患者的異體種植腫瘤細(xì)胞(LuCaP)為主要模型,研究了藤黃酸在抗轉(zhuǎn)移性CRPC中的作用及機(jī)制。1.不同中藥單體對前列腺癌(Prostate cancer,PrCa)細(xì)胞的生長抑制作用。1.1基于活血解毒法篩選有效的抗前列腺藥物。以11種不同的中藥單體:隱丹參酮、丹參酮IIA,苦參堿、氧化苦參堿,莪術(shù)醇、姜黃素,鹽酸小蘗堿,貝母素甲、貝母素乙,槲皮素和藤黃酸,按濃度梯度分別處理PCAP-1細(xì)胞,48h后用CTG檢測活細(xì)胞比例。1.2藤黃酸對PCAPs細(xì)胞和PCAPs干/祖細(xì)胞的生長抑制實驗。以不同濃度的藤黃酸分別處理2維培養(yǎng)的PCAPs細(xì)胞和3維培養(yǎng)的PCAP-1細(xì)胞的細(xì)胞球,24h或48h后用CTG檢測PCAPs的活細(xì)胞比例;1周后行細(xì)胞成球試驗(Sphere forming assay,SFA)和CTG-3D分別檢測干/祖細(xì)胞的成球率和細(xì)胞球的活細(xì)胞數(shù)。1.3藤黃酸對人前列腺癌細(xì)胞系的生長抑制實驗。以不同濃度的藤黃酸處理LNCaP、PC-3、DU145細(xì)胞,24h或48h后用CTG檢測LNCaP、PC-3、DU145的活細(xì)胞比例。1.4藤黃酸對LuCaPs干/祖細(xì)胞的生長抑制實驗。以不同濃度的藤黃酸分別處理來源于不同轉(zhuǎn)移性CRPC且具有不同遺傳異質(zhì)性的LuCaPs,包括23.1、73、92、136、167細(xì)胞,2周后行SFA和CTG-3D分別檢測干/祖細(xì)胞的成球率和細(xì)胞球的活細(xì)胞數(shù)。2.藤黃酸對PCAP-1細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。2.1藤黃酸對PCAP-1的細(xì)胞周期調(diào)控作用。以500nM藤黃酸處理PCAP-1和B6WT細(xì)胞不同時間后,用PI染液將細(xì)胞染色,用流式細(xì)胞儀檢測各周期細(xì)胞所占比例。2.2藤黃酸對PCAP-1細(xì)胞內(nèi)CASP水平的調(diào)控作用。以500nM藤黃酸處理PCAP-1和B6WT細(xì)胞不同時間后,用WB檢測細(xì)胞內(nèi)CASP-3,8,9蛋白及對應(yīng)活化物水平的變化。2.3 Z-VAD-FMK對藤黃酸作用的影響。以500nM藤黃酸單獨或聯(lián)合Z-VAD-FMK或DFOM處理PCAP-1細(xì)胞,24h后行CTG實驗,檢測Z-VAD-FMK或DFOM對藤黃酸抑制PCAP-1細(xì)胞生長作用的影響。3.活性氧類(ROS)在藤黃酸抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡中的作用。3.1藤黃酸對PCAP-1和LuCaPs細(xì)胞內(nèi)ROS和線粒體膜電位(MMP)的影響。以500nM藤黃酸分別處理PCAP-1細(xì)胞、LuCaP92和LuCaP136的干/祖細(xì)胞,用CM-H2DCFDA將細(xì)胞染色后,用流式細(xì)胞分析檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化;同時用JC-1和TMRM將細(xì)胞染色后,分別行Confocal和流式細(xì)胞分析檢測細(xì)胞內(nèi)MMP的變化。3.2 NAC聯(lián)合藤黃酸對PCAP-1和LuCaPs細(xì)胞增殖抑制作用的影響。以不同濃度的藤黃酸單獨或聯(lián)合NAC分別處理PCAP-1細(xì)胞、LuCaP92和LuCaP136細(xì)胞,培養(yǎng)24h或2周后,用流式細(xì)胞分析檢測NAC對PCAP-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響,用CTG和CTG-3D分別檢測NAC對藤黃酸抑制PCAP-1和LuCaPs的生長抑制作用的調(diào)節(jié),用WB檢測NAC對藤黃酸誘導(dǎo)的PCAP-1細(xì)胞內(nèi)CASP活化的調(diào)節(jié)。4.藤黃酸對硫氧還蛋白(Trx)抗氧自由基系統(tǒng)的抑制作用。4.1篩選藤黃酸引起細(xì)胞內(nèi)ROS聚集的機(jī)制。用不同濃度的藤黃酸單獨或聯(lián)合不同的 ROS 激活劑:包括 Rotenone,AntimycinA,BSO,Dioscin,AUR,處理 PCAP-1、LuCaP136細(xì)胞,24h后用CTG檢測PCAPs的活細(xì)胞比例;2周后用CTG-3D檢測LuCaP136的活細(xì)胞比例,篩選出對藤黃酸有協(xié)同作用的單體。4.2藤黃酸對Trx活性的抑制作用。用不同濃度的藤黃酸處理PCAP-1和LuCaP136細(xì)胞和相應(yīng)的細(xì)胞提取物,用Trx活性檢測試劑盒檢測藤黃酸對Trx活性的影響,同時分別檢測藤黃酸對Trx系統(tǒng)中其他兩個重要成員:TrxR和NADPH活性的影響。5.藤黃酸對多西他賽、恩雜魯胺抗轉(zhuǎn)移性CRPC作用的影響。用不同濃度的藤黃酸與多西他賽、恩雜魯胺聯(lián)合處理LuCaP73、LuCaP92、LuCaP136,2周后用CTG-3D檢測細(xì)胞活性,觀察藤黃酸對多西他賽、恩雜魯胺抗腫瘤作用的影響。結(jié)果:藤黃酸抗CRPC的作用及機(jī)制如下所述。1.藤黃酸顯著抑制CRPC細(xì)胞及干/祖細(xì)胞的生長。1.1 以PCAP-1細(xì)胞為研究對象的增殖抑制實驗結(jié)果提示藤黃酸是在測11中單體中抗細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)的單體,抑制效率是隱丹參酮、姜黃素的50幾倍。1.2 藤黃酸呈濃度、時間依賴性抑制PCAP-1以及其他三株來源于不同基因工程小鼠的PCAPs細(xì)胞的增殖,B6WT對藤黃酸的反應(yīng)性明顯弱于PCAPs;SFA和CTG-3D的結(jié)果提示藤黃酸呈濃度依賴性抑制PCAPs干/祖細(xì)胞的生長,200nM藤黃酸可完全抑制PCAP-1細(xì)胞成球。1.3 藤黃酸呈濃度、時間依賴性抑制LNCaP、PC-3、DU145細(xì)胞的生長,抑制作用略弱于PCAP-1細(xì)胞。1.4 藤黃酸呈濃度依賴性抑制LuCaPs細(xì)胞的的成球和生長,不同LuCaPs細(xì)胞對藤黃酸敏感性不同,但500nM藤黃酸可完全抑制在測LuCaPs細(xì)胞的成球。2.藤黃酸誘導(dǎo)PCAP-1細(xì)胞發(fā)生凋亡和鐵凋亡。2.1 藤黃酸500nM作用4h可使PCAP-1細(xì)胞內(nèi)subG1期細(xì)胞明顯增多,但對B6WT細(xì)胞的subG1期無明顯作用。2.2 藤黃酸500nM從6h開始誘導(dǎo)PCAP-1細(xì)胞內(nèi)CASP-3,8,9活化,而對B6WT細(xì)胞內(nèi)CASP的活化無明顯作用。2.3 Z-VAD-FMK、DFOM單用和聯(lián)合均可不同程度的抑制藤黃酸對PCAP-1細(xì)胞的生長抑制,其中以Z-VAD-FMK作用更為顯著。3.藤黃酸引起的ROS聚集是其對列腺癌細(xì)胞生長抑制、凋亡誘導(dǎo)的原因。3.1 藤黃酸可顯著引起PCAP-1細(xì)胞內(nèi)ROS呈時間、濃度依賴性聚集,同時還可降低PCAP-1細(xì)胞的MMP,但對B6WT細(xì)胞內(nèi)ROS無明顯影響;藤黃酸也能呈時間依賴性降低LuCaP92和LuCaP136細(xì)胞的MMP。3.2 流式細(xì)胞分析檢測提示NAC可完全中和藤黃酸導(dǎo)致的PCAP-1細(xì)胞內(nèi)的ROS聚集。CTG實驗發(fā)現(xiàn)NAC可完全逆轉(zhuǎn)藤黃酸對PCAP-1細(xì)胞的生長抑制作用,即便是1μM的藤黃酸;WB實驗發(fā)現(xiàn)NCA可完全逆轉(zhuǎn)藤黃酸對PCAP-1細(xì)胞內(nèi)CASP-3,8,9的活化。在LuCaPs中,NAC也能明顯逆轉(zhuǎn)藤黃酸對LuCaPs細(xì)胞的生長抑制,其中LuCaP92對NAC的作用最為敏感。4.藤黃酸顯著抑制硫氧還蛋白的活性。4.1 AUR可以明顯增強(qiáng)藤黃酸對PCAP-1和LuCaP136細(xì)胞的增殖抑制作用,而BSO對藤黃酸的作用無明顯影響。4.2藤黃酸可明顯抑制PCAP-1和LuCaP136細(xì)胞和細(xì)胞提取物內(nèi)的Trx活性,而不抑制TrxR和NADPH的活性。5.藤黃酸在1μM濃度以下即可明顯增強(qiáng)多西他賽、恩雜魯胺對LuCaP73、92、136的生長抑制作用。結(jié)論:以不同來源的CRPC細(xì)胞為研究對象,我們均發(fā)現(xiàn)藤黃酸可通過抑制Trx的活性,破壞腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS系統(tǒng)的平衡,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS聚集,從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡、鐵凋亡;藤黃酸在CRPC的治療中可增強(qiáng)多西他賽、恩雜魯胺的作用;NAC在CRPC模型中對藤黃酸作用的部分逆轉(zhuǎn)提示了藤黃酸可能存在基于不同遺傳背景的其他作用機(jī)制�？偟膩碚f,藤黃酸誘導(dǎo)的ROS平衡失調(diào)對前列腺癌具有顯著的抑制作用,同時可能存在其他抗CRPC作用機(jī)制,在抗CRPC的治療中具有廣泛地應(yīng)用前景。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect and mechanism of Gambogic acid ( GA ) on the growth inhibition of prostate cancer cell line ( PCAP - 1 ) . The effects of NAC on the growth inhibition of PCAP - 1 cells , LuCaP92 and LuCaP136 cells were investigated by flow cytometry . The results showed that NAC could significantly inhibit the growth inhibition of PCAP - 1 and LuCaP136 cells , but not inhibit the activity of TrxR and NADPH . The results showed that NAC could significantly inhibit the growth inhibition of PCAP - 1 and LuCaP136 cells .
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.25

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