本文選題：急性腎損傷 + 顆粒蛋白前體　； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究目的與意義急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)是一種嚴(yán)重的臨床綜合征,具有很高的發(fā)病率和死亡率。AKI的誘發(fā)原因很多,如腎毒性藥物、腎缺血再灌注、膿毒癥等。盡管AKI的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,越來越多的研究證實(shí)炎癥反應(yīng)在其中發(fā)揮了重要作用。固有免疫系統(tǒng)是人體的第一道防線,其主要功能是通過起始免疫反應(yīng)清除病原體并介導(dǎo)損傷組織的修復(fù)。固有免疫系統(tǒng)可經(jīng)模式識別受體識別病原相關(guān)的分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)或損傷相關(guān)的分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)而激活。在AKI中,模式識別受體的異常激活會導(dǎo)致過強(qiáng)的炎癥反應(yīng),造成組織損傷。但目前尚無有效的方法預(yù)防和治療AKI。因此,開發(fā)新型的預(yù)防和治療AKI的策略迫在眉睫。顆粒蛋白前體(progranulin, PGRN)是一種由593個氨基酸構(gòu)成的自分泌性生長因子,結(jié)構(gòu)上由七個半富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。PGRN的表達(dá)十分廣泛,除在上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中高表達(dá)外,在其他的一些組織和細(xì)胞中也有表達(dá),如骨骼肌、脂肪組織、造血細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等。PGRN具有多種生物學(xué)功能,并廣泛參與多種疾病進(jìn)程,如自身免疫性疾病、動脈粥樣硬化、腫瘤等。近年來,PGRN的抗炎作用受到廣泛關(guān)注。在急性感染模型中,PGRN可以抑制脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的釋放。PGRN在慢性炎癥中也具有保護(hù)作用,重組PGRN可以顯著減輕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動物模型中的炎癥反應(yīng)。此外,最近的一項(xiàng)研究報(bào)道,PGRN可以與Toll樣受體9 (Toll-likereceptor 9, TLR-9)結(jié)合,提高固有免疫系統(tǒng)清除病原微生物的能力。炎癥反應(yīng)是AKI的重要機(jī)制,然而PGRN在AKI中的表達(dá)與功能尚不清楚。因此,深入探討PGRN在AKI的作用具有十分重要的意義。研究方法1 PGRN在腎缺血再灌注模型中的表達(dá)變化1.1小鼠腎缺血再灌注模型的構(gòu)建及PGRN的檢測選取12周齡雄性野生型(wild type, WT) C57BL/6、PGRN缺失型Grn-/-) (B6(Cg)-Grntml.lAidi/J)以及NOD2缺失型(Nod2-/-) (B6.129S1-Nod2tmlFlv/J)小鼠。使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠后,沿中線切開腹腔,使用微動脈夾夾住雙側(cè)腎蒂30分鐘(min),之后移去動脈夾,觀察5min,確保血液復(fù)流,開始計(jì)時,12、24、48、72小時(h)后,處死小鼠,取材。使用蛋白質(zhì)免疫印跡法(western blot, WB)、Real-time RT-PCR和免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry, IHC)檢測PGRN在腎缺血再灌注腎組織中表達(dá)變化。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測小鼠血清中的PGRN。1.2 PGRN與腎小管不同部位標(biāo)記物的共定位采用組織免疫熒光(immunofluoresce, IF)方法對PGRN與腎小管不同部位的標(biāo)記物蛋白進(jìn)行熒光雙染。1.3體外模型的建立及PGRN的檢測體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)；采用三種方法模擬低氧環(huán)境,分別是：低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h,之后轉(zhuǎn)為正常培養(yǎng)；抗霉素A/2-脫氧葡萄糖處理細(xì)胞90min,之后轉(zhuǎn)為正常培養(yǎng)；不同濃度氯化鈷(CoCl2)處理12h。WB檢測三種條件下HK-2細(xì)胞中PGRN的蛋白水平的變化。2 PGRN在小鼠腎缺血再灌注損傷中的功能2.1野生型與Grn-/-小鼠腎臟功能學(xué)指標(biāo)對比安捷倫1100高效液相色譜(high-performance liquid chromatography, HPLC)系統(tǒng)測定野生型與Grn-/-。小鼠血清中肌酐的含量。羅氏cobas 8000全自動生化分析儀測定野生型與Grn-/-小鼠血清中尿素氮的含量。2.2野生型與Grn-/-小鼠腎臟形態(tài)學(xué)損傷對比蘇木素-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)對野生型與Grn-/-小鼠腎臟石蠟切片染色,并對其形態(tài)學(xué)損傷進(jìn)行評分。原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling, TUNEL)對野生型與Grn-/-小鼠腎臟石蠟切片染色。2.3小鼠腎缺血再灌注模型炎癥相關(guān)指標(biāo)的檢測ELISA檢測野生型與Grn-/-小鼠腎勻漿中促炎因子的含量。IHC檢測野生型與Grn-/-小鼠腎臟切片中性粒細(xì)胞標(biāo)記蛋白Ly6B,巨噬細(xì)胞標(biāo)記蛋白CD68。2.4重組PGRN對抗霉素A/2-脫氧葡萄糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥及凋亡的影響Real-time RT-PCR檢測重組PGRN對抗霉素A/2-脫氧葡萄糖處理?xiàng)l件下HK-2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。Annexin V/PI染色后,使用流式細(xì)胞術(shù)檢測重組PGRN對抗霉素A/2-脫氧葡萄糖處理?xiàng)l件下HK-2細(xì)胞凋亡的影響。Caspase-3活性檢測試劑盒檢測Caspase-3的活性,WB檢測Bcl-2及Bax的蛋白水平。2.5外源注射重組PGRN對小鼠腎缺血再灌注損傷的影響對野生型與Grn-/-小鼠術(shù)前6h、術(shù)后6h及術(shù)后12h分別注射重組PGRN。檢測小鼠血清中肌酐與尿素氮的含量。HE染色方法對小鼠腎臟石蠟切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)染色。IHC檢測小鼠腎臟切片中性粒細(xì)胞標(biāo)記蛋白Ly6B,巨噬細(xì)胞標(biāo)記蛋白CD68。 ELISA檢測小鼠腎勻漿中促炎因子的含量。3 PGRN對NOD2信號通路的影響WB檢測野生型與Grn-/-小鼠腎臟NOD2的蛋白水平。WB檢測重組PGRN對小鼠腎臟NOD2蛋白水平的影響。WB檢測重組PGRN對抗霉素A/2-脫氧葡萄糖處理?xiàng)l件下NOD2表達(dá)的影響。WB檢測重組PGRN對MDP (NOD2激活劑)誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的影響。IF檢測HK-2細(xì)胞中p65的定位與轉(zhuǎn)位。Real-time RT-PCR檢測重組PGRN對MDP誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞促炎因子mRNA水平的影響。4 PGRN在順鉑誘導(dǎo)的小鼠AKI中的功能研究4.1順鉑誘導(dǎo)的小鼠AKI模型構(gòu)建及PGRN的檢測選取12周齡WT(C57BL/6)、Grn-/-(B6(Cg)-Grntml.lAidi/J)雄性小鼠,腹腔注射順鉑(30mg/kg體重)構(gòu)建AKI模型。WB檢測順鉑誘導(dǎo)的小鼠AKI模型腎臟組織中PGRN的蛋白水平。4.2 PGRN缺失對順鉑誘導(dǎo)的AKI的影響測定野生型與Grn-/-小鼠血清中肌酐的含量。HE染色方法對野生型與Grn-/-小鼠腎臟石蠟切片染色,并對其形態(tài)學(xué)損傷進(jìn)行評分。4.3外源性注射重組PGRN對順鉑誘導(dǎo)的小鼠AKI的影響對野生型小鼠順鉑注射前6h注射重組PGRN。檢測小鼠血清中肌酐的含量。HE染色方法對小鼠腎臟切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)染色,并對其形態(tài)學(xué)損傷進(jìn)行評分。4.4重組PGRN對川頁鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥及凋亡的影響WB檢測順鉑誘導(dǎo)下HK-2細(xì)胞PGRN蛋白水平的變化,Real-time RT-PCR檢測PGRN對順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞促炎因子的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測檢測重組PGRN對順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的影響。研究結(jié)果1 PGRN在腎缺血再灌注模型中的表達(dá)變化1.l小鼠腎缺血再灌注損傷模型腎臟中PGRN水平顯著降低Real-time RT-PCR及WB檢測小鼠腎臟中PGRN的表達(dá)。結(jié)果顯示,腎缺血再灌注損傷小鼠腎臟中的PGRN的mRNA與蛋白水平較假手術(shù)組顯著下降,這一結(jié)果在IHC結(jié)果中得到了證實(shí)。1.2 PGRN主要表達(dá)在腎皮質(zhì)與外髓質(zhì)近曲小管與遠(yuǎn)曲小管中IF檢測發(fā)現(xiàn),PGRN主要表達(dá)在。腎皮質(zhì)與外髓質(zhì)近曲、遠(yuǎn)曲腎小管中,在髓質(zhì)集合管中表達(dá)較弱。1.3體外模型條件下PGRN的蛋白水平顯著降低采用三種方法模擬低氧即低氧培養(yǎng)、抗霉素A/2-脫氧葡萄糖、CoCl2處理HK-2細(xì)胞。三種模擬低氧條件下,PGRN的蛋白水平均顯著下降。2 PGRN在腎缺血再灌注損傷中具有保護(hù)作用2.1 PGRN缺失加重了腎缺血再灌注損傷Grn-/-小鼠較野生型小鼠血清中肌酐水平更高；腎臟損傷更加嚴(yán)重,細(xì)胞死亡數(shù)更多；腎臟勻漿中促炎介質(zhì)的水平更高,浸潤的中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的數(shù)量更多。2.2外源重組PGRN減輕腎缺血再灌注損傷對野生型與Grn-/-小鼠術(shù)前6h注射重組PGRN可以顯著的減輕腎缺血再灌注損傷,表現(xiàn)為血清中的肌酐尿素氮水平降低；腎臟形態(tài)學(xué)損傷減輕；腎臟勻漿中促炎介質(zhì)的水平降低；浸潤的中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的數(shù)量減少。術(shù)后6h、12h注射重組PGRN也可以起到一定的保護(hù)作用。2.3重組PGRN減輕A/2-脫氧葡萄糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)與凋亡PGRN顯著降低抗霉素A/2-脫氧葡萄糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中促炎因子的升高、凋亡細(xì)胞的增多、Caspase-3的活性以及Bax與Bcl-2的比例的增加。3 PGRN負(fù)調(diào)控NOD2介導(dǎo)的信號通路PGRN的缺失使得腎缺血再灌注損傷小鼠腎臟中NOD2的蛋白水平進(jìn)一步升高。對小鼠注射重組PGRN可以降低腎臟中的NOD2的蛋白水平,這一結(jié)果也在體外實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。MDP激活HK-2細(xì)胞中的NF-κB信號通路,表現(xiàn)為p65、IκB的磷酸化；IkB的降解以及p65的入核,這些過程均可被PGRN所抑制。PGRN還可以抑制MDP誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞促炎因子的升高。4 PGRN減輕順鉑誘導(dǎo)的AKI體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,順鉑可以降低PGRN的蛋白水平。PGRN的缺失導(dǎo)致順鉑誘導(dǎo)的AKI更加嚴(yán)重。重組PGRN可以顯著減輕順鉑誘導(dǎo)的AKI。體外實(shí)驗(yàn)顯示,重組PGRN可以抑制順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞促炎因子的升高。研究結(jié)論與創(chuàng)新性1.本研究首次表征PGRN在AKI中的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)腎缺血再灌注損傷小鼠腎臟中PGRN的表達(dá)水平顯著降低,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PGRN缺失加重腎缺血再灌注損傷,重組PGRN對缺血再灌注引起的腎損傷具有明顯的防洛作用。這一結(jié)果同樣在順鉑誘導(dǎo)的AKI模型中得到證實(shí)。本研究為設(shè)計(jì)和開發(fā)PGRN相關(guān)蛋白質(zhì)藥物并更好地應(yīng)用于AKI的防治提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。2.本研究首次發(fā)現(xiàn)PGRN可以負(fù)調(diào)控NOD2介導(dǎo)的信號通路,證明了PGRN的腎臟保護(hù)作用至少部分依賴于其對NOD2信號通路的負(fù)調(diào)控作用。本研究有助于進(jìn)一步闡明模式識別受體在AKI中的作用,并提出針對模式識別受體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)進(jìn)行疾病干預(yù)的可能性。
[Abstract]:鐮旂┒鐩殑涓庢剰涔夋，

本文編號：1910191