本文選題：膀胱癌 + 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子��； 參考：《西南醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:利用RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù),靶向下調(diào)膀胱癌T24細(xì)胞的VEGF(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá),觀察下調(diào)膀胱癌T24細(xì)胞VEGF表達(dá)后對(duì)外周血來源的DC(dendritic cell,DC)前體細(xì)胞分化成熟的影響。利用膀胱癌T24細(xì)胞的全抗原制備DC疫苗進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究,觀察下調(diào)VEGF后的DC疫苗介導(dǎo)的特異性T淋巴細(xì)胞對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的殺傷作用。方法:利用RNAi技術(shù),以慢病毒為載體,構(gòu)建LV-VEGFA-RNAi,轉(zhuǎn)染膀胱癌T24細(xì)胞,下調(diào)膀胱癌T24細(xì)胞的VEGF表達(dá)。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分為3組:轉(zhuǎn)染組(LV-VEGF)、陰性轉(zhuǎn)染組(LV-CO)及未轉(zhuǎn)染組(CO)。用倒置顯微鏡及熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)及熒光表達(dá)情況。利用q RT-PCR以及ELISA檢測(cè)各組膀胱癌T24細(xì)胞VEGF的m RNA和蛋白表達(dá)水平。制備三組DC疫苗:對(duì)照組(常規(guī)完全培養(yǎng)液)、干擾組(25%體積分?jǐn)?shù)的轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)上清)以及未干擾組(25%體積分?jǐn)?shù)的未轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)上清)。在體外利用rh IL-4(recombinant human interleukin-4,rh IL-4),rh GM-CSF(recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor,rh GM-CSF)誘導(dǎo)DC分化,第8天各組加入膀胱癌T24細(xì)胞全抗原,2h后加入LPS(Lipopolysaccharides,LPS)刺激DC成熟。繼續(xù)培養(yǎng)至第14天,通過倒置顯微鏡觀察DC形態(tài),流式細(xì)胞技術(shù)鑒定DC表型:CD1a、CD83、CD86。利用尼龍毛柱法從人外周血中分離出T淋巴細(xì)胞,進(jìn)一步用流式細(xì)胞技術(shù)鑒定CD3+T淋巴細(xì)胞。利用MTT法檢測(cè)各組DC疫苗刺激T淋巴細(xì)胞增殖及活化的T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性,同時(shí)收集上清液,ELISA法檢測(cè)IL-10、IL-12及IFN-γ水平。收集、整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:以慢病毒為載體的RNAi序列成功下調(diào)膀胱癌T24細(xì)胞VEGF的表達(dá),與未轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染組膀胱癌T24細(xì)胞VEGF的m RNA及蛋白表達(dá)水平下降(P0.05),陰性轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比,二者無差別(P0.05)。三組DC疫苗經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型,與對(duì)照組相比,干擾組、未干擾組DC表面分子CD1a、CD83、CD86表達(dá)均有不同程度下降(P0.05);與未干擾組比較,干擾組DC表面分子CD1a、CD83、CD86表達(dá)均上調(diào)(P0.05)。三組DC分泌IL-10、IL-12存在差異(P0.05),與對(duì)照組相比,干擾組與未干擾組培養(yǎng)上清中IL-12含量有不同程度下降,而IL-10含量存在不同程度的升高。各組DC體外對(duì)自體T淋巴細(xì)胞刺激能力不同(P0.001),對(duì)照組DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力(SI:10.90±0.49)最強(qiáng),未干擾組DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力(SI:8.03±0.39)最弱,與未干擾組相比,干擾組DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力(SI:8.81±0.41)增強(qiáng)(P0.001)。各組DC激活T淋巴細(xì)胞的得到的CTL對(duì)T24靶細(xì)胞的殺傷存不同,干擾組(46.23±1.07)%、未干擾組(32.50±0.38)%與對(duì)照組(54.64±0.90)%殺傷率存在差異(P0.001),對(duì)照組DC刺激形成的CTL細(xì)胞殺傷T24細(xì)胞的能力最強(qiáng),未干擾組DC刺激形成的CTL殺傷T24細(xì)胞的能力最弱,干擾組CTL殺傷T24細(xì)胞的能力比未干擾組更強(qiáng)(P0.001)。三組負(fù)載抗原的DC活化T淋巴細(xì)胞后分泌的IFN-γ量不全相同,干擾組(37.45±0.38)pg/ml、未干擾組(21.87±0.30)pg/ml與對(duì)照組(51.08±0.41)pg/ml之間存在差異,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。結(jié)論:膀胱癌T24細(xì)胞分泌的VEGF在體外抑制DC的分化成熟,進(jìn)一步抑制了DC介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。體外抑制腫瘤VEGF的表達(dá),有利于增強(qiáng)DC疫苗介導(dǎo)的CTL對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of down - regulation of VEGF in bladder cancer cell line 24 by using RNA interference ( RNAi ) technique . The levels of IL - 10 , IL - 12 and IFN - 緯 were detected by ELISA . Results : Compared with the control group , the levels of IL - 12 and IL - 12 increased significantly ( P0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.14

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1886285