本文選題：霉酚酸酯 + 糖尿病腎病　； 參考：《山東大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究目的 糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)以早期腎臟體積增大、晚期腎小球硬化為主要特征,腎臟細(xì)胞的增殖、肥大與凋亡參與了DN的發(fā)生、發(fā)展。本研究采用體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞培養(yǎng)相結(jié)合的方法,通過觀察糖尿病大鼠及高糖刺激下的腎小球足細(xì)胞肥大、凋亡狀態(tài),測定細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑(cyclin-kinase inhibitors, CKIs)p27kip1、p21cipt及凋亡相關(guān)基因bcl-2、bax、cleaved caspase-3的表達(dá),觀察霉酚酸酯(mycophenolate mofetil, MMF)對足細(xì)胞肥大、凋亡的影響,為治療DN提供科學(xué)的理論依據(jù)。 研究方法 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：32只雄性健康Wistar大鼠,腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(STZ),另外8只作為對照組(NC)。注射STZ72小時(shí)后剪尾采血,測血糖16.7mmol/L,尿糖陽性,表明糖尿病模型成功建立。將糖尿病造模成功的32只大鼠,隨機(jī)分為糖尿病組(DM)、霉酚酸酯組(DM+M)、纈沙坦組(DM+V)及霉酚酸酯+纈沙坦聯(lián)合治療組(DM+M.V),每組8只。成模2天后,治療組分別給予MMF15mg.kg-1.d-1,纈沙坦40mg.kg-1.-1,聯(lián)合治療給予MMF15mg.kg-1.d-1+纈沙坦40mg.kg-1.d-1,1mg/d灌胃；而NC組和DM組每日予等量溶媒灌胃,共16周(w)。分別檢測五組大鼠4w、8w及16w的左腎重/體重、血糖、血壓、內(nèi)生肌酐清除率及24小時(shí)尿蛋白排泄量；光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察糖尿病大鼠腎組織形態(tài)學(xué)的變化；免疫組織化學(xué)法檢測腎皮質(zhì)nephrin.WT1蛋白的表達(dá)；TUNEL法檢測足細(xì)胞的凋亡率；Western-blot半定量及熒光實(shí)時(shí)定量PCR的分析方法,檢測腎組織中p27kip1、p21cipt及bcl-2.bax.cleaved caspase-3的表達(dá)。 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：訂購的小鼠腎足細(xì)胞,按培養(yǎng)液中葡萄糖、霉酚酸(mycophenolic acid,MPA).纈沙坦的含量不同分為：①正常對照組NG(葡萄糖濃度5.6mmol/L+2.5%FBS的DMEM);②高糖組HG(葡萄糖濃度25mmol/L);③HG+M組：HG(葡萄糖濃度25mmol/L)+MPA2.5×10-7mol/L;④HG+V組:HG(葡萄糖濃度25mmol/L)+纈沙坦10-7mol/L;作用72小時(shí)(h)。采用流式細(xì)胞儀測定12h、24h、48h、72h各時(shí)間點(diǎn)足細(xì)胞的肥大指數(shù)及凋亡率,運(yùn)用Western-blot半定量及熒光實(shí)時(shí)定量PCR的分析方法,檢測腎小球足細(xì)胞中p27kip1、p21cip1及bcl-2、bax、cleaved caspase-3的表達(dá)。 結(jié)果 1.臨床參數(shù) 與NC組比較,DM大鼠血糖明顯升高、體重減輕、肥大指數(shù)增加,24小時(shí)尿蛋白排泄量及肌酐清除率均明顯增高(P0.01)。16周末,DM大鼠腎重/體重指數(shù)較NC組明顯升高(8.49±1.21vs4.57±0.82,P0.01)；而霉酚酸酯和/或纈沙坦治療16w后,腎重/體重指數(shù)明顯降低,差異有顯著性(PO.01)；但各藥物治療組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。16w末,DM大鼠尿蛋白量較NC組明顯升高(55.37±2.33vs10.52±0.66,P0.05);同樣藥物治療16w后,24小時(shí)尿蛋白排泄量明顯降低,差異有顯著性(P0.01)；各給藥組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 2.腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察 光鏡：4周前糖尿病大鼠無明顯變化。此后,隨著實(shí)驗(yàn)周期的延長,糖尿病大鼠腎小球的體積逐漸增大、系膜區(qū)逐漸增寬,且基底膜增厚、毛細(xì)血管腔受壓、變窄；與NC組比較,16周末DM組腎小球的硬化指數(shù)(1.15±0.12vs0.15±0.05,P0.01)及間質(zhì)纖維化積分(0.58±0.08vs0.12±0.04,P0.01)明顯增加,其差異有顯著性；各藥物治療組較DM組均有不同程度的改善。 電鏡：糖尿病大鼠腎小球毛細(xì)血管基底膜均質(zhì)性增厚和系膜基質(zhì)增多,伴足細(xì)胞足突的廣泛融合,并可見裸露的基底膜及脫落的足細(xì)胞。MMF和/或纈沙坦治療后,足突的融合減輕,系膜基質(zhì)及足細(xì)胞的脫落均明顯減少。 3.腎組織中nephrin、WT-1蛋白及mRNA的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色顯示：正常大鼠nephrin、WT1沿腎小球基底膜呈棕黑色線形分布,而糖尿病大鼠的線樣沉積變淡、變細(xì)、甚至消失,經(jīng)MMF和/或纈沙坦治療后,其線樣沉積又恢復(fù)至粗線狀。 從第4周開始糖尿病組大鼠腎組織中nephrin蛋白(2.08±0.42vs2.63±0.51,P0.05)及WT1蛋白(1.26±0.2vs1.59±0.26,P0.05)的表達(dá)減少,且隨著時(shí)間的推移nephrin、WT1蛋白的表達(dá)進(jìn)一步降低。各治療組與DM組比較,nephrin、WT1的表達(dá)均有不同程度的升高(P0.05)；且16w末nephrin蛋白的表達(dá)DM+M組(1.83±0.43)及DM+M. V組(1.75±0.31)療效優(yōu)于DM+V組(1.39±0.28),有顯著性差異(P0.05)；而各藥物治療組間WT1蛋白的表達(dá)無明顯差異(P0.05)。 從第4周開始DM組大鼠腎組織中nephrin mRNA (0.87±0.13vs0.95±0.091, P0.05)、WT1mRNA (0.92±0.095vs1.04±0.079, P0.05)的表達(dá)下降,且隨著時(shí)間的推移其mRNA的表達(dá)進(jìn)一步降低。而經(jīng)霉酚酸酯和/或纈沙坦治療后,nephrin、WT1mRNA的表達(dá)均有不同程度的上調(diào)(P0.05),16周末WT1mRNA的表達(dá)霉酚酸酯聯(lián)合治療組(1.30±0.25)優(yōu)于纈沙坦組(1.04±0.23),(P0.05),而nephrin mRNA的表達(dá)三治療組間比較無明顯差異(P0.05)。 4.足細(xì)胞肥大指數(shù) 高糖組足細(xì)胞肥大從24小時(shí)開始(0.828±0.23vs0.678±0.16,P0.05),且隨著時(shí)間的推移足細(xì)胞進(jìn)一步肥大。各治療組與高糖組比較,霉酚酸治療組足細(xì)胞肥大從24小時(shí)開始減輕,而纈沙坦治療組從48小時(shí)開始明顯減輕,且隨著時(shí)間推移,療效逐漸增強(qiáng)(P0.05)。 5. p27kip1、p21cip1蛋白及mRNA的表達(dá) 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：從第4周開始DM組大鼠腎組織中p27kip1、p21cipl蛋白及mRNA的表達(dá)增強(qiáng),與正常對照組相比有顯著性差異(P0.05),16周末達(dá)高峰。各治療組與DM組比較,p27kip1、p21cipl蛋白及mRNA的表達(dá)從第8周開始降低(P0.05),且隨著實(shí)驗(yàn)周期的延長,p27kip1、p21cip1蛋白及mRNA的表達(dá)進(jìn)一步降低；16w末p27kipl蛋白、mRNA及p21cip1mRNA的表達(dá),霉酚酸酯+纈沙坦聯(lián)合治療組優(yōu)于纈沙坦組(P0.05)。 體外足細(xì)胞培養(yǎng)：p27kip1、p21cipl蛋白及mRNA的表達(dá)：從24小時(shí)開始,HG組小鼠足細(xì)胞p27kip1、p21cip1蛋白及mRNA水平開始升高,與NG組相比差異有顯著性(P0.05)。且隨著時(shí)間的推移,p27kipl和p21cipl蛋白及mRNA的表達(dá)進(jìn)一步升高。霉酚酸及纈沙坦可明顯降低p27kip1和p21cip1蛋白的表達(dá),且72小時(shí)末p27kip1蛋白的表達(dá)霉酚酸的療效優(yōu)于纈沙坦(P0.05)；霉酚酸和纈沙坦亦可明顯降低p27kip1mRNA的表達(dá),而p21cip1mRNA的表達(dá)僅霉酚酸起到明顯的抑制作用。 6.足細(xì)胞凋亡率 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)第8周糖尿病大鼠足細(xì)胞凋亡率開始增高(2.63±0.31vs0.84±0.26,P0.01),且隨著實(shí)驗(yàn)的延長,足細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增高。各治療組與DM組相比,均有不同程度的下降；16周末霉酚酸酯單一治療組(1.81±0.27)及聯(lián)合治療組(1.24±0.19)優(yōu)于纈沙坦組(2.25±0.33),差異有顯著性(P0.05)。 體外足細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：高糖培養(yǎng)48小時(shí)后,足細(xì)胞凋亡率明顯高于NG組(4.97±0.58vs2.77±0.31,P0.05)。兩治療組,僅霉酚酸治療72小時(shí)后足細(xì)胞凋亡率降低(P0.05),而纈沙坦治療組無變化(P0.05),且72小時(shí)末霉酚酸的療效優(yōu)于纈沙坦,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 7. bax、bcl-2、cleaved caspase-3蛋白及mRNA的表達(dá) 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：糖尿病大鼠的bax、cleaved caspase-3蛋白及mRNA的表達(dá)從實(shí)驗(yàn)第8周起明顯升高,而bcl-2的表達(dá)下降,差異有顯著性(P0.05)。各治療組與DM組比較,其表達(dá)均有不同程度的改善；且16周末bax/bcl-2蛋白的表達(dá),DM+M組(1.42±0.2)、DM+M. V組(1.57±0.26)與DM+V(1.95±0.24)比較差異有顯著性,(P0.01)。 體外足細(xì)胞培養(yǎng)：高糖培養(yǎng)下,足細(xì)胞的bax、cleaved caspase-3蛋白及mRNA的表達(dá)從實(shí)驗(yàn)第48小時(shí)起升高,而bcl-2的表達(dá)下降,差異有顯著性(P0.05),且隨著時(shí)間的推移比值進(jìn)一步升高。經(jīng)霉酚酸或纈沙坦治療后,其比值較HG組下降,差異有顯著性(P0.01)；且72小時(shí)末bax/bcl-2、cleaved caspase-3蛋白的表達(dá),HG+M組較HG+V組明顯降低,差異有顯著性(P0.05)。 結(jié)論： 1.足細(xì)胞的肥大與凋亡參與了糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。糖尿病早期,足細(xì)胞的肥大伴隨著細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑p27kip1、p2cip1表達(dá)的增高。隨著糖尿病病程的進(jìn)展,足細(xì)胞的凋亡率增高,晚期的腎小球硬化與其過度凋亡有關(guān),并伴隨著凋亡相關(guān)基因bax、cleaved caspase-3表達(dá)的升高及bc1-2表達(dá)的降低。 2.霉酚酸酯和纈沙坦可有效的抑制腎小球足細(xì)胞的肥大與凋亡,調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(p27kip1、p21cip1)和凋亡相關(guān)基因(bax、bcl-2、cleaved caspase-3)的表達(dá),起到一定的保護(hù)作用。因此,推測霉酚酸酯可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控蛋白p27kip1、p21cip及凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2及cleaved caspase-3的表達(dá),抑制和阻斷腎小球足細(xì)胞的肥大與凋亡,從而起到降低蛋白尿、延緩糖尿病腎病進(jìn)展的作用。
[Abstract]:Purpose of study

Diabetic nephropathy ( DN ) was characterized by the increase of early renal volume , late glomerulosclerosis as the main characteristic , the proliferation , hypertrophy and apoptosis of kidney cells were involved in the development and development of DN .

Research Methods

In vivo animal experiment : Thirty - two male healthy Wistar rats were injected intraperitoneally with streptozocin and 8 as control group ( NC ) . Thirty - two rats were randomly divided into diabetic group ( DM ) , mycophenolate mofetil group ( DM + M ) , valsartan group ( DM + V ) and mycophenolate + valsartan combined therapy group ( DM + M.V ) .
The left kidney weight / body weight , blood glucose , blood pressure , endogenous creatinine clearance rate and 24 hour urinary protein excretion were measured in five groups of rats 4w , 8w and 16w .
Changes of renal tissue morphology in diabetic rats were observed by optical microscopy and electron microscopy ;
Expression of bax , bcl - 2 , caspase - 3 protein and mRNA
TUNEL method was used to detect the apoptosis rate of foot cells .
The expression of p27kip1 , p21 cipt and bcl - 2 . bax were detected by Western - blot semi - quantitative and real - time quantitative PCR .

In vitro cell experiment : The mouse kidney - foot cells were ordered , and glucose and mycophenolic acid ( MPA ) were added to the culture solution . The contents of valsartan were divided into two groups : 鈶，

本文編號：1876797