本文選題：自噬 + 腎癌　； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景腎透明細(xì)胞癌約占成人惡性腫瘤的2%~3%,截止2016年的統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)顯示腎癌仍是我國發(fā)病率約第10位的惡性腫瘤,為成人腎臟惡性腫瘤的主要部分。近些年來其發(fā)病率呈逐年上漲趨向,全球每年約有10萬人死于腎癌,腎癌分布總體上發(fā)病年齡可見于各年齡段,高發(fā)年齡為50~70歲,最近流行病學(xué)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示男性腎癌發(fā)病率略多于女性,地區(qū)差異也比較明顯,城市稍高于農(nóng)村。目前腎癌因缺乏早期特異性的診斷方法導(dǎo)致大部分患者診斷時腫瘤已發(fā)展至中晚期。盡管現(xiàn)在對腎癌的認(rèn)識有了很大的進(jìn)步,診療手段也日益增多,但由于腎癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍未明確,故腎癌目前仍以手術(shù)治療為主,術(shù)后患者生存率仍不太理想。目前,還沒有公認(rèn)的可用于臨床診斷腎癌的腫瘤標(biāo)志物。腎癌的術(shù)前診斷主要依靠腹部影像學(xué)檢查,然而,因影像學(xué)診斷的限制,腹部CT一般只能發(fā)現(xiàn)直徑大于5mm以上的腎癌,并且確診還需病理學(xué)檢查。因此,探索腎癌可能發(fā)生發(fā)展及耐藥的分子機(jī)制對腎癌的診斷、治療及預(yù)后評估具有重要意義。目前研究已證明,細(xì)胞自噬主要有三種存在形式,包括大自噬(macroautophagy,MA)、分子伴侶自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)和小自噬(microautophagy)。大自噬(macroautophagy,MA)即通常所說的自噬,是使用雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)包裹胞內(nèi)短效周期蛋白形成自噬泡,并且與次級溶酶體(溶酶體)融合后,在溶酶體內(nèi)酸性蛋白降解酶的作用下進(jìn)行降解再利用。一般在體外細(xì)胞培養(yǎng)中,細(xì)胞經(jīng)過血清饑餓誘導(dǎo)短期內(nèi)(4-6小時)可以達(dá)到高峰。對于小自噬目前研究相對較少,主要是指是通過溶酶體直接與目的蛋白進(jìn)行融合后降解。近來研究發(fā)現(xiàn),自噬可以通過代謝自身蛋白質(zhì)和細(xì)胞器來逃避外界應(yīng)激,以此來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)并促進(jìn)細(xì)胞存活,新近發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞往往通過自噬來增強(qiáng)其對抗癌藥物的耐藥性,以此逃避腫瘤藥物的殺傷作用。自噬相關(guān)基因5(ATG5)作為常用自噬檢測關(guān)鍵基因之一,其表達(dá)水平與自噬明顯相關(guān)。微管相干蛋白1輕鏈3(LC3)是目前研究最多的自噬標(biāo)志性基因之一,其共同參與自噬體的形成,是自噬特異的常用診斷標(biāo)志物之一。目前,自噬的檢測方法主要包括免疫組織化學(xué)中檢測自噬體的形成、western blot檢測LC3。細(xì)胞增殖情況常用的檢測技術(shù)包括MTT法、流式細(xì)胞術(shù)等。目前,自噬在腎癌中尤其是其耐藥性的研究尚不深入,本研究采用免疫組織化學(xué)染色、慢病毒感染、Western Blot、MTT、流式細(xì)胞術(shù)等多種實驗方法和技術(shù),從分子和細(xì)胞水平,觀察了大自噬在體外腎癌細(xì)胞增殖及舒尼替尼耐藥性中的作用及其分子機(jī)制。主要研究結(jié)果:一、ATG5、LC3在腎透明細(xì)胞癌組織中高表達(dá),且與腎透明細(xì)胞癌的分級及預(yù)后相關(guān)1.對99例腎癌組織和17例癌旁組織進(jìn)行免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn),與癌旁組織相比,ATG5和LC3在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)量明顯升高。臨床病理資料統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),ATG5和LC3的表達(dá)高低與年齡、性別、腫瘤部位無統(tǒng)計學(xué)差異,但與腎癌腫瘤惡性程度、TNM分期密切相關(guān);隨著病理學(xué)分級和TNM臨床分期的增加,ATG5和LC3的表達(dá)依次升高。并且,ATG5高表達(dá)患者生存率較低,預(yù)后較差。二、大自噬促進(jìn)A-498腎癌細(xì)胞株增殖1.通過慢病毒介導(dǎo)的ATG5 shRNA表達(dá)載體感染構(gòu)建低表達(dá)的A-498腎癌細(xì)胞株,并使用Western Blot相關(guān)技術(shù)進(jìn)行驗證,成功構(gòu)建了ATG5低表達(dá)腎癌細(xì)胞株;2.流式細(xì)胞術(shù)檢測ATG5正常表達(dá)與低表達(dá)組中A-498細(xì)胞增殖的變化;3.7天MTT增殖曲線結(jié)果顯示,敲低A-498腎透明細(xì)胞癌株中ATG5表達(dá),能顯著降低腎癌細(xì)胞的增殖能力。4.采用H_2O_2刺激及細(xì)胞活力檢測證明,在氧應(yīng)激情況下,敲低A-498腎癌細(xì)胞株中ATG5表達(dá),能顯著降低腎癌細(xì)胞的存活率。三、抑制自噬能降低腎癌細(xì)胞對舒尼替尼的耐藥性通過MTT實驗發(fā)現(xiàn),ATG5敲低的A-498腎癌細(xì)胞對舒尼替尼藥物的耐藥性增加。本文結(jié)論:自噬可通過抑制ATG5介導(dǎo)的自噬信號通路來刺激腎癌細(xì)胞增殖,本課題為腎癌增殖及治療中耐藥性的研究提供了新的思路,并為臨床腎癌的診治提供新的可能靶點和線索。
[Abstract]:Background renal clear cell carcinoma accounts for about 2%~3% of adult malignant tumors. Statistical data in 2016 show that renal cancer is still the main part of the malignant tumor in China, which is the main part of the adult malignant tumor. In recent years, the incidence of renal cancer is increasing year by year, about 100 thousand people die from renal cancer in the world and the distribution of renal cancer is on the whole. The age of onset is seen in all ages. The age of high incidence is 50~70 years. Recent epidemiological statistics show that the incidence of male kidney cancer is slightly more than that of women. There has been a great progress in the understanding of renal cancer, and the means of diagnosis and treatment are increasing. However, the mechanism of renal cancer is still not clear, so the renal carcinoma is still mainly operated on. The survival rate of the patients is still not ideal. At present, there is no recognized tumor marker for clinical diagnosis of renal cancer. The preoperative diagnosis of renal cancer depends mainly on the diagnosis of renal cancer. Abdominal imaging examination, however, because of the limitation of imaging diagnosis, abdominal CT can only find more than 5mm more than 5mm of renal cancer, and the diagnosis is still necessary for pathological examination. Therefore, it is of great significance to explore the molecular mechanism of the possible development and resistance of renal cancer to the diagnosis, treatment and prognosis of renal cancer. There are three main forms of existence, including macroautophagy (MA), chaperone-mediated autophagy (CMA), and small autophagy (microautophagy). The autophagy (macroautophagy, MA) is usually described as autophagy, which uses a double lipid membrane structure to encapsulate short acting cyclin and form a autophagic bubble, and it is associated with a secondary lysase. After fusion, the body (Rong Meiti) is degraded and reused under the action of the enzyme in vivo acidic protein degrading enzyme. In vitro culture, the cells are induced by serum starvation in the short term (4-6 hours) to reach the peak. The present study is relatively small for the small autophagy, mainly referring to the direct fusion of the target protein through Rong Meiti. Late degradation. Recent studies have found that autophagy can avoid external stress by metabolism of its own proteins and organelles to maintain cell homeostasis and promote cell survival. Recently, tumor cells tend to enhance their resistance to anticancer drugs by autophagy to escape the killing effect of tumor drugs. Autophagy related gene 5 (ATG5) As one of the key genes of autophagy detection, the expression level is obviously related to autophagy. Microtubule coherent protein 1 light chain 3 (LC3) is one of the most widely studied autophagic marker genes. It participates in the formation of autophagic and is one of the most commonly used diagnostic markers for autophagy. In the study, the formation of autophago is detected. The common detection techniques for the detection of LC3. cell proliferation by Western blot include MTT and flow cytometry. At present, the study of autophagy in renal carcinoma, especially its drug resistance, is not deep. This study uses immunohistochemical staining, lentivirus infection, Western Blot, MTT, flow cytometry and other experimental parties. Methods and techniques, from molecular and cellular levels, observed the role of autophagy in the proliferation of renal cell carcinoma cells in vitro and its molecular mechanism. The main results are: 1, ATG5, LC3 are highly expressed in the tissues of renal clear cell carcinoma, and are related to the classification and prognosis of renal clear cell carcinoma in 1. pairs of renal carcinoma tissues and 17 para cancerous tissues Immunohistochemical staining showed that the expression of ATG5 and LC3 in the tissues of renal clear cell carcinoma was significantly higher than that of the para cancerous tissue. The statistical analysis of clinicopathological data found that the expression of ATG5 and LC3 had no statistical difference with age, sex and tumor location, but it was closely related to the malignant degree of renal cancer and TNM staging. The expression of ATG5 and LC3 increased in sequence and TNM, and the survival rate of the ATG5 high expression patients was low and the prognosis was poor. Two, the large autophagy promoted the proliferation of A-498 renal cancer cell line 1. through the lentivirus mediated ATG5 shRNA expression vector to construct the low expression A-498 renal cancer cell line, and used Western Blot related techniques. The ATG5 low expression renal cell carcinoma cell line was successfully constructed, and the 2. flow cytometry was used to detect the changes in the proliferation of A-498 cells in normal ATG5 expression and low expression group. The 3.7 day MTT proliferation curve showed that the expression of ATG5 in low A-498 renal cell carcinoma cells could significantly reduce the proliferation ability of renal cell carcinoma cell.4. by H_2O_2 stimulation and cell viability detection. It was proved that ATG5 expression in low A-498 renal cell carcinoma cells could significantly reduce the survival rate of renal cell carcinoma cells under oxygen stress. Three, inhibition of autophagy could reduce the resistance of renal cancer cells to suneinib by MTT test. The drug resistance of ATG5 cells with low ATG5 knockdown was increased. This conclusion: autophagy can be inhibited by inhibition. ATG5 mediated autophagy signaling pathway to stimulate the proliferation of renal cell carcinoma cells. This topic provides new ideas for the study of the proliferation and drug resistance of renal cancer and provides new possible targets and clues for the diagnosis and treatment of renal cancer.

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.11

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本文編號：1839654