本文選題：腎透明細胞癌 + 反苯環(huán)丙胺��； 參考：《南昌大學》2014年碩士論文

【摘要】：目的： 初步研究賴氨酸特異性脫甲基酶1(LSD1)抑制劑反苯環(huán)丙胺對腎透明細胞癌786-O細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，并初步探討其機制。 方法： 1、細胞活力實驗：細胞培養(yǎng)成功后行MTT實驗檢測不同濃度梯度下的反苯環(huán)丙胺（TCP）干預對數(shù)生長期的786-O細胞24h、48h和72h后的細胞生長抑制率，并設調(diào)零孔和對照組，計算50％致死濃度(IC50)，然后繪制濃度-時間抑制率曲線圖；實驗重復3次。 2、采用流式細胞儀（Annexin V/PI雙染法）分析、計算細胞凋亡率，并繪制曲線圖。 3、Trizol法提取實驗組和對照組細胞總RNA，應用分光光度計法檢測RNA濃度、純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，使用半定量RT-PCR檢測LSD1基因mRNA的表達量變化。 4、Western-blot檢測實驗組和對照組細胞LSD1蛋白表達量變化。 5、采用劃痕試驗觀察TCP對786-O細胞遷移力的影響，拍照觀察12h、24h和48h細胞遷移距離。實驗重復3次。 6、Transwell細胞體外侵襲實驗檢測不同濃度梯度的TCP作用對數(shù)生長期的786-O細胞24h侵襲到Tanswell小室下室面的數(shù)目，同時設立對照組，予以0.1％的結(jié)晶紫染色后拍照。實驗重復3次。 7、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析：所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包的單因素方差分析，P0.05為差異有統(tǒng)計學意義；以P0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義；以P0.05為差異無統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1、不同濃度(0、10、20、40、80、160和320uM)的TCP作用于786-O細胞24h、48h和72h后，MTT法檢測結(jié)果顯示，1‰的DMSO溶液對786-O細胞無影響，TCP對786-O細胞的增殖有抑制作用，10uM以上隨藥物濃度的增大、作用時間的延長，抑制作用隨之增強，呈現(xiàn)明顯的時間-劑量效應關(guān)系(P＜0.01)。計算出24h、48h和72h TCP的IC50值分別為133.76uM、67.66uM和36.02uM。 2、流式細胞儀AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測藥物誘導細胞凋亡分析表明，TCP作用腎癌786-O細胞48h，0uM組、DMSO組和10uM組兩兩比較，凋亡率無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），40uM-160uM組隨濃度的增高，早期凋亡和晚期凋亡細胞的比例都逐漸增加，與對照組相比差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。同時，細胞壞死率也同步增高，說明TCP具有細胞毒性作用，隨藥物濃度增高，毒性隨之增大； 3、 TCP處理786-O細胞48h后LSD1基因mRNA表達量的分析，，40uM和80uM組的表達明顯低于0uM組及1‰DMSO組LSD1基因mRNA表達量（P＜0.01）；0uM組與1‰DMSO組比較，結(jié)果無明顯差異（P＞0.05）； 4、Western-blot分析TCP處理細胞48h后LSD1蛋白在786-O細胞中的表達情況，40uM和80uM組的表達明顯低于0uM組及1‰DMSO組LSD1蛋白表達量（P＜0.01）；1‰DMSO組與0uM組比較，結(jié)果無明顯差異（P＞0.05）； 5、采用劃痕試驗觀察TCP對786-O細胞遷移力的影響，結(jié)果顯示：0uM組24h及48h愈合率分別為35.14%±3.91%、59.46%±4.36%；1‰DMSO組24h及48h愈合率分別為38.12%±3.86%、56.52%±4.68%；40uM組處理24h后愈合率為28.64%±3.15%、處理48h愈合率為39.72%±4.11%；80uM組處理24h愈合率為21.11%±4.18%、處理48h愈合率為30.81%±3.74%。TCP處理786-O細胞后，細胞的遷移能力明顯低于0uM組和1‰DMSO組，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。0uM組和1‰DMSO組比較，遷移力無明顯差異（P0.05)。表明TCP處理后786-O細胞遷移能力明顯下降，且與時間和濃度呈正相關(guān)，1‰DMSO對786-O細胞的遷移力無影響； 6、應用Transwell小室檢測TCP對腎癌786-O細胞侵襲能力的影響，TCP以40、80uM作用腎癌786-O細胞24h，對照組(0uM組、1‰DMSO組)亦作用24h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0uM組、1‰DMSO組兩兩比較，侵襲到平鋪基質(zhì)膠的Transwell小室下室面的細胞數(shù)無明顯差異，分別為286.25±25.81和294.82±24.36，說明1‰DMSO對768-O細胞的侵襲能力無明顯影響；40uM和80uM組侵襲到小室下室面的細胞數(shù)分別為195.86±19.43和115.76±18.56，表明隨濃度的增高，穿過Transwell小室膜的細胞數(shù)逐漸減少，細胞的侵襲力逐漸下降(P0.05)。與對照組相比差異具有顯著性(P＜0.01)。說明TCP對786-O細胞侵襲數(shù)目的抑制呈濃度依賴性。 結(jié)論： 1、LSDl抑制劑TCP在體外可以抑制腎透明細胞癌786-O細胞的增殖，且呈濃度-時間依賴性； 2、TCP可以誘導體外培養(yǎng)的腎透明細胞癌786-O細胞凋亡，且呈濃度依賴性； 3、TCP可以抑制LSD1基因mRNA和蛋白的表達； 4、TCP在體外可有效抑制腎透明細胞癌細胞786-O的遷移和侵襲能力,并呈濃度依賴性。
[Abstract]:Objective:
The effect of lysine specific demethylase 1 (LSD1) inhibitor anti phenylalanine on the proliferation, apoptosis, migration and invasion of 786-O cells in renal clear cell carcinoma cells was preliminarily investigated and its mechanism was preliminarily discussed.
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本文編號：1831002