本文選題：熒光定量PCR芯片 + 尿液mRNA　； 參考：《東南大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的：腎臟纖維化(renal fibrosis, RF)是所有慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)進(jìn)展的共同病理表現(xiàn)。腎臟纖維化發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其中局部炎癥反應(yīng)的形成、炎癥介質(zhì)釋放、腎臟固有細(xì)胞(包括系膜細(xì)胞、足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等)活化和凋亡(或壞死)、胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)堆積是導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)毀損的共同關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前腎臟纖維化診斷主要依賴腎穿刺活檢這一有創(chuàng)性檢查手段,臨床上尚缺乏無創(chuàng)性檢查方法。近年來,尿沉渣細(xì)胞及其分子生物學(xué)信息檢測技術(shù)日益成熟,可能為探索腎臟纖維化相關(guān)生物標(biāo)志物提供嶄新的無創(chuàng)技術(shù)平臺。因此,本研究目的在于：基于尿液mRNA檢測技術(shù),構(gòu)建可同時檢測多種尿液mRNA水平的腎臟纖維化靶向熒光定量PCR (polymerase chain reaction)芯片,發(fā)現(xiàn)和驗證CKD患者腎臟纖維化相關(guān)生物標(biāo)志物,并對IgA腎病(IgA nephropathy, IgAN)患者腎臟纖維化進(jìn)行聯(lián)合生物標(biāo)志物研究。方法：1.基于尿沉渣細(xì)胞：ml RNA檢測技術(shù),選出86種腎臟纖維化可能相關(guān)基因并構(gòu)建靶向表達(dá)譜PCR芯片。選取50例經(jīng)腎臟活檢證實的CKD患者,利用所構(gòu)建的real-time PCR芯片進(jìn)行尿沉渣mRNA檢測評估,分析芯片的靈敏度、特異度和可重復(fù)性分析。2.選取在東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院住院治療的135例經(jīng)腎臟活檢證實的CKD患者和31例健康對照(healthy control, HC),分為篩查組和驗證組。使用所構(gòu)建的腎臟纖維化靶向熒光定量PCR芯片檢測尿沉渣細(xì)胞mRNA表達(dá)水平,分析目標(biāo)基因在CKD患者和健康對照之間的表達(dá)差異,并與血肌酐(serum creatinine, Scr),尿素氮(blood urea nitrogen, BUN),腎小球濾過率(estimate glomerular filtration rate, eGFR),腎小球硬化(glomerular sclerosis, GS)積分和小管間質(zhì)纖維化(tubular interstitial fibrosis, TIF)積分進(jìn)行相關(guān)性分析,篩選出腎臟纖維化的生物標(biāo)志物并在另一組CKD患者中進(jìn)行驗證,評價芯片所篩選的基因?qū)δI臟纖維化的診斷價值。3.選取在東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院住院治療的74例經(jīng)腎臟活檢證實的IgA腎病患者和31例健康對照。構(gòu)建由90個IgA腎病發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因組成的IgA腎病靶向表達(dá)譜PCR芯片并通過芯片檢測IgA腎病患者和健康對照的尿液mRNA,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因,并與腎功能指標(biāo)、牛津分級(Oxford classification)、纖維化評分等相關(guān)性分析,篩選出IgA腎病腎臟纖維化相關(guān)候選基因標(biāo)志物。利用線性判別分析(Fisher's linear discriminant analysis)對候選基因構(gòu)建聯(lián)合生物標(biāo)志物,通過自身驗證和交互驗證評估聯(lián)合標(biāo)志物在IgA腎病患者中腎臟纖維化的診斷價值。結(jié)果：1.本研究構(gòu)建的腎臟纖維化靶向PCR芯片可準(zhǔn)確定量檢測86種目的mRNA。該芯片基因擴(kuò)增曲線圖譜呈S型,熔解曲線分析呈單峰；所有樣本基因檢測陽性率均大于85%；PPC孔均值20.63±0.35,變異度僅為1.69%。2.通過芯片檢測發(fā)現(xiàn)篩查組和驗證組中CKD患者尿液VIM mRNA水平較健康對照組顯著升高。Spearman相關(guān)性分析提示,VIM mRNA水平與血肌酐、尿素氮、腎小球濾過率、腎小球硬化評分和小管間質(zhì)纖維化評分之間存在顯著相關(guān)。Multiple logistic regression進(jìn)一步提示,尿液VIM mRNA表達(dá)水平是腎臟纖維化的重要危險因素并可有效區(qū)分不同嚴(yán)重程度的纖維化。3.IgA腎病腎臟纖維化相關(guān)PCR芯片90個候選基因中,有50個尿液mRNA在IgA腎病和健康對照中存在顯著表達(dá)差異,其中BCL2、CASP3、PAI1、TIMP2、 VIM, P53、SYNPO、MCP-1、TGF-β1的mRNA水平與血清肌酐、eGFR和腎臟纖維化評分顯著相關(guān)。利用BCL2、PAI1、TGF-β1三個基因構(gòu)建的聯(lián)合標(biāo)志物可有效診斷IgA腎病患者腎臟纖維化水平,其中敏感性、特異性、約登指數(shù)分別為91.3%,85.7%,0.77,ROC分析提示曲線下面積為0.92(P0.05)。結(jié)論：1.本研究首次構(gòu)建了一種腎臟纖維化靶向的熒光定量PCR芯片。所構(gòu)建的纖維化靶向PCR芯片具有良好的靈敏度、特異度和可重復(fù)性,為腎臟纖維化無創(chuàng)性診斷提供了新的技術(shù)平臺。2.尿液VIM mRNA水平可有效區(qū)分不同嚴(yán)重程度的纖維化狀態(tài),提示尿液VIMmRNA可能作為腎臟纖維化無創(chuàng)性診斷標(biāo)志物。3.尿液腎臟纖維化相關(guān)BCL2, PAI1和TGF-β1mRNA構(gòu)建的聯(lián)合標(biāo)志物優(yōu)于傳統(tǒng)腎功能相關(guān)標(biāo)志物和單一基因標(biāo)志物,可能成為反映IgAN進(jìn)展的新型生物標(biāo)志物。
[Abstract]:Objective : Renal fibrosis ( RF ) is a common pathological manifestation of the progression of chronic kidney disease ( CKD ) . Objective To evaluate the diagnostic value of renal fibrosis in patients with IgA nephropathy by means of linear discriminant analysis ( Fisher ' s linear discriminant analysis ) .
The positive rate of all samples was more than 85 % .
The results showed that the level of mRNA in urine was significantly correlated with serum creatinine , urea nitrogen , glomerular filtration rate , glomerular sclerosis score and renal fibrosis score .

【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R692

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本文編號：1818938