本文選題：糖尿病腎病 + TAK1��； 參考：《安徽醫(yī)科大學》2015年博士論文

【摘要】：背景和目的:糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最嚴重的慢性微血管并發(fā)癥之一,是導致終末期腎衰竭(end-stage renal failure,ESRF)的主要病因,如何早期有效防治DN已成為當今國內(nèi)外學者密切關(guān)注的課題。DN的發(fā)病機制非常復雜,晚近研究認為除代謝與血流動力學紊亂外,以巨噬細胞激活介導的腎內(nèi)炎癥在DN發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,但糖尿病腎內(nèi)巨噬細胞激活的信號傳導通路尚不清楚。轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(TGF-βactivated kinase 1,TAK1)是絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)家族的成員之一,在功能上位于絲裂原蛋白激酶(MAPK)和IκB激酶的上游。近來研究表明TAK1可以被多種刺激因素激活并活化MAPK通路,且活化的TAK1可磷酸化并激活NIK(NF-κB induced kinase),最后激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB),在細胞的生長、分化、凋亡以及控制各種基因如炎癥因子、細胞粘附分子及生長因子等表達中發(fā)揮重要的作用。本研究采用TAK1抑制劑(5Z-7-oxozeaenol,OZ)分別作用于糖尿病db/db小鼠和小鼠巨噬細胞,從整體、細胞和分子水平系統(tǒng)觀察TAK1信號通路、炎癥因子、趨化因子(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、黏附因子(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)變化,探討TAK1參與早期DN發(fā)生的作用機制。從基因或蛋白水平阻斷TAK1致病作用的有效途徑,進一步闡明DN發(fā)病的分子學機制并為其防治提供新思路。第一部分:健康雄性小鼠36只,選取同窩野生型小鼠(wild type,WT)12只作為正常對照組(WT,n=12),db/db小鼠(db/db,n=12)和db/db小鼠+抑制劑組(db/db+OZ,n=12)。其中db/db小鼠尾尖取血血糖儀測定血糖,血糖≥16.7mmol/L者確定為模型。于用藥第8,12周末收集各組小鼠血、尿和腎組織標本,測定血糖、體重、腎重以及24h尿白蛋白排泄率;光鏡、電鏡觀察腎組織病理改變;免疫組化檢測ED-1,NF-κB p65,MCP-1以及TNF-α;western blot檢測腎組織p-TAK1,TAB1,p-p38MAPK以及IL-1β蛋白的表達;實時定量PCR檢測趨化因子ICAM-1,MCP-1m RNA的表達。方法:第二部分:取小鼠巨噬細胞種植于96孔板,采用CCK-8法分別檢測干預藥物TAK1抑制劑在不同藥物濃度對高糖、AGEs培養(yǎng)巨噬細胞活力的影響。采用6孔板培養(yǎng)細胞,將細胞分組:甘露醇對照組(MN),牛血清白蛋白組(BSA),正常對照組(NC),高糖組(HG),AGEs組(AGEs),高糖+TAK1抑制劑組(HG+OZ30,100,300n M),AGEs+TAK1抑制劑組(AGEs+OZ30,100,300n M),于刺激的相應時間點收集細胞。流式細胞術(shù)檢測高糖、AGEs刺激因素對骨髓來源巨噬細胞的激活作用;提取細胞m RNA及細胞總蛋白,采用實時定量PCR檢測各組細胞中促炎細胞因MCP-1以及TNF-αm RNA的表達;Western blot檢測各組總蛋白中p-TAK1,TAB1,p-JNK,p-p38MAPK,NF-κB p65,IL-1β蛋白的表達。結(jié)果:第一部分:①與對照組相比,8-12周db/db小鼠血糖、體重、腎重及24h尿白蛋白排泄率均明顯升高(P0.01);db/db+OZ組小鼠體重、腎重及24h尿白蛋白排泄率改變較db/db小鼠顯著減輕(P0.05,P0.01)。②8-12周時,光鏡觀察db/db小鼠腎小球體積增大、系膜細胞增多、基底膜增厚以及細胞外基質(zhì)增多,電鏡觀察db/db小鼠腎小球基底膜局部隆起不規(guī)則增厚,足細胞足突融合;db/db+OZ組腎組織的病理改變則明顯得到改善(P0.05)。③免疫組化結(jié)果顯示,8-12周db/db小鼠較對照組ED-1,NF-κB p65,MCP-1和TNF-α蛋白的表達明顯上調(diào)(P0.05);db/db+OZ組與db/db組相比,ED-1,NF-κB p65,MCP-1和TNF-α蛋白的表達則明顯降低(P0.05)。④Western blot結(jié)果顯示,8-12周db/db小鼠較對照組p-TAK1,TAB1,p-p38MAPK和IL-1β蛋白的表達明顯上調(diào)(P0.05);db/db+OZ組與db/db組相比,p-TAK1,TAB1,p-p38MAPK和IL-1β蛋白的表達則明顯下降(P0.05);非磷酸化TAK1,p38MAPK在各組的表達均無明顯差異(P0.05)。⑤實時定量PCR結(jié)果顯示,db/db小鼠較對照組小鼠趨化因子ICAM-1,MCP-1 m RNA表達明顯增加(P0.01);db/db+OZ組與db/db組相比,ICAM-1,MCP-1 m RNA表達則明顯抑制(P0.05,P0.01)。第二部分:①與正常對照相比,10,30,100和300 nmol/L抑制劑對HG,AGEs培養(yǎng)的骨髓來源巨噬細胞活力無明顯影響(P0.05),1000nmol/L抑制劑對巨噬細胞活力有影響(P0.05)。②實時定量PCR檢測結(jié)果顯示,與NC組相比,HG,AGEs組細胞MCP-1,TNF-αm RNA的表達明顯上調(diào)(P0.01);抑制劑組與HG,AGEs相比,MCP-1,TNF-αm RNA的表達則明顯下調(diào)(P0.05,P0.01)。③流式細胞術(shù)檢測HG,AGEs刺激因素可成功誘導骨髓來源巨噬細胞功能表型向M1型巨噬細胞活化;抑制劑干預使M1型巨噬細胞表面標記物表達百分比明顯降低(P0.05,P0.01)。④Western blot結(jié)果顯示p-TAK1,TAB1,p-JNK,p-p38MAPK,NF-κB p65和IL-1β蛋白在HG、AGEs組的表達強于NC(P0.05)組;但抑制劑組蛋白表達明顯弱于HG,AGEs組(P0.05)。TAK1,JNK,p38MAPK在各組的表達無明顯變化(P0.05)。結(jié)論:1體內(nèi)實驗初步證實,糖尿病狀態(tài)下p-TAK1在腎臟表達增強,伴有腎小球系膜細胞增殖、細胞外基質(zhì)積聚、巨噬細胞活化等腎臟炎癥病理改變,提示p-TAK1在糖尿病腎病發(fā)生機制中可能起一定作用。2 db/db小鼠腎組織p-TAK1,TAB1,p-p38MAPK和NF-κB p65的表達上調(diào)及ICAM-1,MCP-1,TNF-α,IL-1β的合成增加,TAK1抑制劑可以下調(diào)MAPK,NF-κB信號通路以及炎癥因子的表達,提示TAK1促發(fā)糖尿病腎病發(fā)生的機制可能與MAPK以及NF-κB信號通路激活有關(guān),但具體作用途徑有待進一步研究闡明。3高糖、晚期糖基化產(chǎn)物環(huán)境下,骨髓來源巨噬細胞活化,細胞內(nèi)TAK1,MAPK和NF-κB信號傳導通路表達上調(diào),高表達IL-1β,MCP-1,TNF-α;TAK1抑制劑抑制MAPK以及NF-κB信號通路激活,下調(diào)巨噬細胞炎癥因子的表達。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE : Diabetic nephropathy ( DN ) is one of the most serious complications of diabetic nephropathy , which is the main cause of end - stage renal failure ( ESRF ) . n=12),db/db灝忛紶(db/db,n=12)鍜宒b/db灝忛紶+鎶戝埗鍓傜粍(db/db+OZ,n=12). The expression of p - TAK1 , TAB1 , p - p38MAPK and IL - 1尾protein in rats were measured by means of CCK - 8 . The results showed that the levels of p - TAK1 , TAB1 , p - p38MAPK and IL - 1尾protein were detected by Western blot . Compared with the control group , the expressions of ED - 1 , TAB1 , p - p38MAPK and IL - 1尾 in db / db mice were significantly higher than those in the control group ( P0.05 ) . Compared with NC group , the expression of MCP - 1 and TNF - 偽m RNA was significantly decreased compared with NC group ( P0.05 , P0.01 ) . 鈶，

本文編號：1811695