本文選題：目標區(qū)域捕獲結(jié)合高通量測序 + 非梗阻性無精子癥(NOA)　； 參考：《吉林大學》2016年博士論文

【摘要】：目的利用目標區(qū)域捕獲結(jié)合高通量測序技術(shù)篩查N OA患者相關(guān)S NV變異,通過Case-Control study進行關(guān)聯(lián)研究,并初步探索致病機制,進一步揭示導致N OA的遺傳學因素;構(gòu)建N OA相關(guān)的S NV庫,為下一階段擴大樣本量研究提供參考位點。本研究系列為最終建立能夠應用于臨床的N OA遺傳診斷平臺提供理論和實驗基礎,為可能涉及到進行性加重的不育患者或通過輔助生殖技術(shù)生育的不育子代提供生育力保存或遺傳病因?qū)W診斷咨詢依據(jù)。方法NOA組納入自2013年9月至2014年12月因“男性不育”到吉林大學第一醫(yī)院生殖中心就診,并確診為NOA的患者,對照組納入自2013年9月至2014年12月到吉林省人類精子庫捐精的志愿者,NOA組和對照組均需經(jīng)G顯帶染色體核型分析和外周血Y染色體AZF微缺失檢測確認無染色體異常和AZF微缺失,并進行民族等基本信息和精索靜脈曲張等既往史和現(xiàn)病史的排查;本研究參考OMIM、GENCODE、Ref Seq、Vega Genome Browser和Pubmed等數(shù)據(jù)庫,收集經(jīng)動物模型研究、RNA/蛋白表達譜研究、全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)和SNV統(tǒng)計分析研究報道的NOA相關(guān)基因,在此基礎上制備針對NOA相關(guān)基因外顯子區(qū)域的目標區(qū)域捕獲結(jié)合高通量測序平臺;本研究對NOA組患者和對照組志愿者經(jīng)專業(yè)問卷調(diào)差的形式收集年齡等基本信息,采用手淫取精的方式收集精液樣本用于精液常規(guī)分析和精漿生化分析,取前臂淺靜脈血用于外周血血清生殖激素水平檢測;本研究應用目標捕獲結(jié)合高通量測序技術(shù)對NOA組患者和對照組志愿者的目標基因外顯子區(qū)域進行測序,整體流程包括全基因組文庫制備、目標區(qū)域捕獲測序和生物信息學分析3個部分;本研究最后應用Case-Control study進行SNV與NOA關(guān)聯(lián)研究并構(gòu)建NOA相關(guān)SNV library為下一階段擴大樣本量驗證提供參考位點,關(guān)聯(lián)研究主要包括NOA組和對照組SNV篩選、NOA組和對照組次等位基因頻率(MAF)對比、SNV與NOA相關(guān)性研究、SNV基因型分析、基因型與臨床表型關(guān)聯(lián)研究等步驟、SNV單體型分析等步驟,SNV library構(gòu)建主要包括貝勒流程、對照組MAF為0條件篩選和library描述等步驟。結(jié)果1.NOA組共計納入34例符合標準的患者,對照組共計納入40例符合標準的受檢者。2.經(jīng)參考文獻和公共數(shù)據(jù)庫,共計納入467個NOA相關(guān)基因,并制備了針對NOA相關(guān)基因外顯子區(qū)域的目標區(qū)域捕獲結(jié)合高通量測序平臺。3.對NOA組患者和對照組受試者基本信息的收集和臨床指標檢測表明NOA組和對照組在平均年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、精子密度、血清卵泡刺激素(FSH)水平、血清黃體生成素(LH)、血清泌乳素(PRL)水平、血清睪酮(T)水平、血清抑制素B水平、精漿果糖水平、α糖苷酶水平和精漿鋅水平存在統(tǒng)計學差異(p0.05),在精索靜脈曲張率、精液量和血清雌二醇(E2)水平等方面無統(tǒng)計學差異(p0.05)。4.目標區(qū)域捕獲結(jié)合高通量測序產(chǎn)出大量高質(zhì)量數(shù)據(jù),Align rate≥95%(推薦參考值)的樣本比例為100%、所有樣本讀深≥20×覆蓋率介于99.9%-92%之間、所有樣本Duplication rate≤20%(推薦臨界值)的樣本比例達到100%。5.對74例樣本經(jīng)測序所得共計178966例變異,65%分布在內(nèi)含子區(qū)域,24%分布在外顯子區(qū)域,10%分布在開放閱讀框(ORF)上下游調(diào)控區(qū)域,其余1%分布于屬于非調(diào)控區(qū)的基因間隔內(nèi);對74例樣本經(jīng)測序所得178966例變異的變異方式進行統(tǒng)計對比結(jié)果表明檢出變異主要分為SNV和插入缺失標記(Indel)兩種,檢出的SNV類型包括非同義突變(nonsynonymous)、同義突變(synonymous)、無義突變(stopgain)、終止密碼子丟失(stoploss)和剪接突變(splicing),檢出的Indel突變類型包括移碼突變(frameshift)、非移碼突變(non-frameshift)和終止密碼子丟失,此外檢出的SNV和Indel都包含大量效果未知的變異(unknown),NOA組和對照組比較各種已知效果變異方式的檢出頻率差異無統(tǒng)計學意義(p0.05),未知效果變異檢出頻率差異有統(tǒng)計學意義(p0.001)。6.Case-Control study針對分布于外顯子的SNV類型的變異進行研究,對74例樣本經(jīng)測序檢出的總計178966例變異進行篩選,結(jié)果分布于外顯子區(qū)域測序深度≥20×的SNV變異總計41452例,全部變異分布于2391個(種)SNV位點。7.本研究對74例樣本測序檢出結(jié)果中篩選出的2391個候選SNV位點在NOA組與對照組間進行等位基因頻率統(tǒng)計對比,并同時計算各個候選SNV在NOA組和對照組中的哈迪溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE),結(jié)果顯示包括BRDT c.1949CT(rs10747493)等65個候選SNV等位基因頻率在NOA組與對照組間存在統(tǒng)計學差異(p0.05),其中BRDT c.1949CT(rs10747493)等38個SNV的基因型在NOA組和對照組中的分布均符合哈迪溫伯格平衡(p0.05)。8.本研究對經(jīng)NOA組和對照組間等位基因頻率統(tǒng)計對比有統(tǒng)計學差異,且基因型分布符合哈迪溫伯格平衡的38個SNV進行與NOA發(fā)病的關(guān)聯(lián)分析,并同時以“年齡”因素為協(xié)變量進行相關(guān)性校正,結(jié)果表明KIF2C c.531AT(rs3795713)等18個SNV經(jīng)校正后與NOA相關(guān)性仍有統(tǒng)計學意義(p0.05),其中MTRR c.537TC(rs161870,OR:3.686)等5個SNV與NOA發(fā)病呈正相關(guān),KIF2C c.531AT(rs3795713,OR:0.291)等13個SNV與NOA發(fā)病呈負相關(guān),所有18個SNV在HGMD數(shù)據(jù)庫中均無NOA致病性報道。9.本研究對經(jīng)過關(guān)聯(lián)性分析得出的18個與NOA呈顯著相關(guān)性的SNV的顯性模型與隱性模型進行分析,并同時以“年齡”因素為協(xié)變量進行校正,結(jié)果顯示17個SNV顯性或隱性基因型與NOA相關(guān)。其中MTRR c.537TC(rs161870)等10個SNV在校正后顯性模型分析仍有統(tǒng)計學意義(p0.05),其中MTRR c.537TC(rs161870,OR:4.024)等3個SNV在顯性模式下與NOA發(fā)病呈正相關(guān),KIF2C c.531AT(rs3795713,OR:0.293)等7個SNV在顯性模式下與NOA發(fā)病呈負相關(guān),TAF4B c.1815TC(rs1677016)等7個SNV在校正后隱性模型分析有統(tǒng)計學意義,其中TAF4B c.1815TC(rs1677016,OR:5.457)等2個SNV在隱性模式下與NOA發(fā)病呈正相關(guān),HLA-DPB1 c.292AG(rs1042140,OR:0.059)等5個SNV在隱性模式下與NOA發(fā)病呈負相關(guān)。10.本研究對SNV基因型與NOA相關(guān)臨床表型進行關(guān)聯(lián)研究,結(jié)果顯示MTRR c.537TC(rs161870)等8個SNV的基因型頻率在不同NOA相關(guān)臨床表型正常值組和異常值組間存在顯著性差異。其中MTRR c.537TC(rs161870,OR:3.231),MTRR c.1049AG(rs162036,OR:3.231)和PIWIL1 c.1580GA(rs1106042,OR:3.592)顯性基因型與FSH高值存在正相關(guān);ACE c.81CT(rs4316,OR:2.858),ACE c.471AG(rs4331,OR:2.858),ACE c.606GA(rs4343,OR:2.858)和ACE c.1665TC(rs4362,OR:3.771)隱性基因型與PRL高值存在正相關(guān);PIWIL1 c.1580GA(rs1106042)顯性基因型與T低值存在正相關(guān),與抑制素B異常存在正相關(guān);TAF4B c.1815TC(rs1677016,OR:3.871)隱性基因型與精漿α糖苷酶異常存在正相關(guān)。11.本研究對NOA相關(guān)SNV單體型分析結(jié)果表明,KIF2C c.531AT(rs3795713)等5個SNV在1號染色體上形成2個單倍體block,KIF2C c.531AT(rs3795713)等3個SNV形成block1,有2種單體型,分別為AAG和TCA,AAG在NOA組的頻率顯著高于對照組(83.8%vs.68.8%,p=0.033),TCA在NOA組的頻率顯著低于對照組(16.2%vs.31.2%,p=0.033),MAEL c.12TC(rs2296837)等2個SNV形成block2,有3種單體型,分別為TT、CG和CT,TT在NOA組的頻率顯著高于對照組(86.8%vs.68.8%,p=0.009),CG在NOA組的頻率顯著低于對照組(13.2%vs.28.7%,p=0.022),CT在NOA組的頻率和對照組相比無統(tǒng)計學差異(p0.05);MTRR c.537TC(rs161870)等2個SNV在5號染色體上形成1個單倍體block,block中有2種單體型,分別為TA和CG,TA在NOA組的頻率顯著低于對照組(80.9%vs.92.5%,p=0.035),CG在NOA組的頻率顯著高于對照組(19.1%vs.7.5%,p=0.035);HLA-DPB1 c.313AG(rs1042151)等2個SNV在6號染色體上形成1個單倍體block,block中有3種單體型,分別為AG、GA和AA,AG在NOA組的頻率顯著高于對照組(94.1%vs.77.5%,p=0.005),GA在NOA組的頻率顯著低于對照組(4.4%vs.15%,p=0.033),AA在NOA組的頻率和對照組相比無統(tǒng)計學差異;ACE c.81CT(rs4316)等4個SNV在17號染色體上形成1個單倍體block,block中有3種單體型,分別為TGAC、CAGT和TGAT,TGAC在NOA組的頻率顯著低于對照組(51.5%vs.76.2%,p=0.002),CAGT在NOA組的頻率顯著高于對照組(41.2%vs.21.2%,p=0.009),TGAT在NOA組的頻率和對照組相比無統(tǒng)計學差異(p0.05)。12.本研究應用貝勒流程對N OA組內(nèi)M AF無組間統(tǒng)計學差異的S NV行進一步篩選,結(jié)果表明經(jīng)N OA組與對照組間等位基因頻率對比差異無統(tǒng)計學意義的NOA組S NV變異共計62376例,最終篩選出可能致病單核苷酸突變(SNM)變異共計73例。13.本研究對貝勒流程篩選出的SNM進一步篩選對照組內(nèi)等位基因頻率為0的SNV,結(jié)果表明經(jīng)貝勒流程篩選得到的73例候選SNM經(jīng)篩選對照組內(nèi)等位基因頻率為0的SNM變異共計42例,分布于39個SNM位點上,位于34個基因內(nèi)。14.經(jīng)NOA組與對照組組間等位基因頻率對比及NOA相關(guān)性研究所得52個NOA非負相關(guān)SNV位點和經(jīng)貝勒流程篩選及對照組等位基因頻率為0篩選所得39個SNM位點共同構(gòu)成SNV library。對SNV library成分構(gòu)成進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明NOA發(fā)病呈正相關(guān)SNV位點占SNV library的(5/91)5%,經(jīng)NOA組與對照組等位基因頻率對比有統(tǒng)計學差異且符合哈迪溫伯格平衡,但經(jīng)關(guān)聯(lián)性分析與NOA發(fā)病并無顯著相關(guān)性,占SNV library的(20/91)22%,經(jīng)NOA組與對照組等位基因頻率對比有統(tǒng)計學差異但不符合哈迪溫伯格平衡,占SNV library的(27/91)30%,經(jīng)貝勒流程篩選及對照組等位基因頻率為0篩選所得SNM位點,占SNV library(39/91)43%;對SNV library位點在公共數(shù)據(jù)庫的分布進行統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示僅能在HGMD數(shù)據(jù)庫中檢索到NOA相關(guān)致病性記錄,在db SNP數(shù)據(jù)庫中無相應SNP記錄,占SNV library的(1/91)1%,僅能在db SNP數(shù)據(jù)庫中檢索到多態(tài)性信息,在HGMD數(shù)據(jù)庫中無相應NOA相關(guān)致病性記錄,占SNV library的(80/91)88%,在HGMD數(shù)據(jù)庫中檢索到NOA相關(guān)致病性記錄,并在db SNP數(shù)據(jù)庫中檢索到多態(tài)性信息,占SNV library的(6/91)7%,不能在HGMD數(shù)據(jù)庫中檢索到NOA相關(guān)致病性記錄,也不能在db SNP數(shù)據(jù)庫中檢索到多態(tài)性信息,占SNV library的(4/91)4%;對SNV library位點變異效果進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明突變效果為非同義突變,占SNV library的(57/91)63%,突變效果為同義突變,占SNV library的(34/91)37%。結(jié)論(1)本研究經(jīng)篩查發(fā)現(xiàn)18個SNV與NOA存在相關(guān)性,此前均無NOA致病性報道,其中MTRR c.537TC(rs161870)、MTRR c.1049AG(rs162036)、PIWIL1c.1580GA(rs1106042)、TAF4B c.1815TC(rs1677016)和SOX10 c.927TC(rs139884)5個SNV增加NOA致病風險;KIF2C c.531AT(rs3795713)、KIF2C c.1345AC(rs4342887)、KIF2C c.1500GA(rs1140279)、MAEL c.12TC(rs2296837)、MAEL c.121TG(rs11578336)、HLA-DRB1 c.227TA(rs17884945)、HLA-DPB1 c.292AG(rs1042140)、HLA-DPB1 c.313AG(rs1042151)、HLA-DPB1 c.315GA(rs1042153)、ACE c.81CT(rs4316)、ACE c.471AG(rs4331)、ACE c.606GA(rs4343)和ACE c.1665TC(rs4362)13個SNV降低NOA致病風險,具有保護效應。(2)研究結(jié)果表明17個SNV顯性/隱性基因型與NOA相關(guān),其中MTRR c.537TC(rs161870)、MTRR c.1049AG(rs162036)和PIWIL1 c.1580GA(rs1106042)3個SNV在顯性模式下與增加NOA致病風險;KIF2C c.531AT(rs3795713)、KIF2C c.1345AC(rs4342887)、KIF2C c.1500GA(rs1140279)、MAEL c.12TC(rs2296837)、MAEL c.121TG(rs11578336)、HLA-DPB1 c.313AG(rs1042151)和HLA-DPB1 c.315GA(rs1042153)7個SNV在顯性模式下降低NOA致病風險,具有保護效應;TAF4B c.1815TC(rs1677016)和SOX10 c.927TC(rs139884)2個SNV在隱性模式下增加NOA致病風險;HLA-DPB1 c.292AG(rs1042140)、ACE c.81CT(rs4316)、ACE c.471AG(rs4331)、ACE c.606GA(rs4343)和ACE c.1665TC(rs4362)5個SNV在隱性模式下降低NOA致病風險,具有保護效應。(3)研究結(jié)果表明8個SNV顯性/隱性基因型可導致生殖激素或/和精漿生化水平改變。MTRR c.537TC(rs161870),MTRR c.1049AG(rs162036)和PIWIL1c.1580GA(rs1106042)顯性基因型可能通過導致FSH水平異常增高增加NOA致病風險;ACE c.81CT(rs4316),ACE c.471AG(rs4331),ACE c.606GA(rs4343)和ACE c.1665TC(rs4362)隱性基因型可能通過導致PRL水平異常增高降低NOA致病風險;PIWIL1 c.1580GA(rs1106042)顯性基因型可能通過導致T水平異常降低和抑制素B水平異常降低增加NOA致病風險;TAF4B c.1815TC(rs1677016)隱性基因型可能通過導致精漿α糖苷酶水平異常降低增加NOA致病風險。(4)研究結(jié)果表明10個單體型與NOA相關(guān),其中KIF2C c.531AT(rs3795713)、KIF2C c.1345AC(rs4342887)和KIF2C c.1500GA(rs1140279)在1號染色體上形成NOA相關(guān)單倍體block1,MAEL c.12TC(rs2296837)和MAEL c.121TG(rs11578336)在1號染色體上形成NOA相關(guān)單倍體block2,block1的單倍體AAG和block2的單倍體TT是NOA發(fā)病易感因素,block1的單倍體TCA和block2的單倍體CG具有保護效應;MTRR c.537TC(rs161870)和MTRR c.1049AG(rs162036)在5號染色體上形成NOA相關(guān)單倍體block,其中單倍體CG是NOA發(fā)病易感因素,單倍體TA具有保護效應;HLA-DPB1 c.313AG(rs1042151)和HLA-DPB1 c.315GA(rs1042153)2個SNV在6號染色體上形成NOA相關(guān)單倍體block,其中單倍體AG是NOA發(fā)病易感因素,單倍體GA具有保護效應;ACE c.81CT(rs4316)、ACE c.471AG(rs4331)、ACE c.606GA(rs4343)和ACE c.1665TC(rs4362)在17號染色體上形成NOA相關(guān)單倍體block,其中單倍體CAGT是NOA發(fā)病易感因素,單倍體TGAC具有保護效應。(5)SNV library由52個NOA非負相關(guān)SNV位點和39個SNM位點共計91個SNV位點構(gòu)成。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R698.2
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本文編號：1810119