本文選題：精子 + P34H��； 參考：《貴州醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：目的:研究精子蛋白P34H表達對人精子頂體內(nèi)頂體酶(arcosin)活性、透明質酸酶(hyaluronidase,HYD)活性和精漿中性α-糖苷酶(neutralα-glucosidase,NAG)活性及精子受精能力 的關系。通過構建慢病毒介導的能夠穩(wěn)定沉默小鼠附睪中P34H基因的干擾載體,觀察其對小鼠精子中P34HmRNA、P34H蛋白的表達和小鼠精子P34H陽性率的抑制作用;并通過慢病毒介導的RNAi敲低P34H表達后分析對小鼠精子頂體內(nèi)頂體酶活性、透明質酸酶活性和精子體外受精率的影響。方法:1.收集人精液標本共88例,將其分為20例正常生育組和68例不育組。按照世界衛(wèi)生組織(WHO)頒布的標準對精液進行常規(guī)分析檢測,根據(jù)精液參數(shù)的不同將不育標本分為正常精液參數(shù)不育組28例和精液參數(shù)異常不育組40例。通過實時熒光定量PCR法,測定P34HmRNA的表達量;Western blot測定P34H蛋白在人精子中的表達;免疫熒光用來觀測P34H蛋白在人精子上的定位。2.運用改良明膠底物膜法檢測精子頂體內(nèi)arcosin活性(arcosin陽性反應率、arcosin活性強度);采用改良透明質酸鈉-明膠底物膜法進行精子頂體內(nèi)HYD活性的檢測(HYD反應陽性率、HYD活性強度);采用精漿中性α-糖苷酶定量檢測試劑盒(酶法)檢測NAG活性;3.設計3條P34H的siRNA的靶點序列,合成含干擾序列的shRNA,分別與雙酶切后的載體連接,構建 3 種重組質粒 GV-P34H-shRNA1、GV-P34H-shRNA2 和GV-P34H-shRNA3,并轉化于細菌感受態(tài)細胞,提取陽性克隆并進行測序驗證,分別將重組質粒與慢病毒包裝質粒共轉染293T細胞。將3種重組慢病毒及陰性對照病毒分別注入小鼠附睪中,將10μl病毒液分別按正常對照組、GV-NC-shRNA 陰性感染組、GV-P34H-shRNA-1 感染組、GV-P34H-shRNA-2感染組及GV-P34H-shRNA-3感染組共5組注射。用Realtime-PCR和Western blot分別檢測P34H mRNA和P34H蛋白的沉默效果,免疫熒光觀察P34H蛋白在小鼠精子上的表達。4.按正常對照組、GV-NC-shRNA陰性感染組、GV-P34H-shRNA-l 感染組、GV-P34H-shRNA-2 感染組及 GV-P34H-shRNA-3 感染組5組,應用金霉素熒光染色法檢測頂體反應率;采用改良明膠底物膜法檢測頂體酶活性(頂體酶陽性反應率和頂體酶活性強度);改良透明質酸鈉-明膠底物膜法對小鼠精子透明質酸酶(HYD)活性進行檢測(HYD反應陽性率、HYD活性強度);與小鼠超排卵子進行體外受精實驗檢測受精率。結果:1.實時熒光定.量PCR檢測結果顯示:與正常生育組比較,不育各組(正常精液參數(shù)不育組和精液參數(shù)異常不育組)的P34H基因mRNA的相對表達量均明顯低于正常生育組(P0.05);正常精液參數(shù)不育組的P34H基因mRNA相對表達量與精液參數(shù)異常不育組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。Western blot檢測:不育各組(正常精液參數(shù)不育組和精液參數(shù)異常不育組)精子P34H/β-actin平均光密度均明顯低于正常生育組(P0.05);正常精液參數(shù)不育組與精液參數(shù)異常不育組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。間接免疫熒光染色顯示:不育各組(正常精液參數(shù)不育組和精液參數(shù)異常不育組)精子P34H陽性率均明顯低于正常生育組(P0.05);正常精液參數(shù)不育組與精液參數(shù)異常不育組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。精子P34H/β-actin平均光密度、精子P34H陽性率在NAG活性正常組與NAG活性異常組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.不育各組(正常精液參數(shù)不育組和精液參數(shù)異常不育組)的arcosin活性(arcosin陽性反應率、arcosin活性強度)明顯低于正常生育組(P0.05)。正常精液參數(shù)不育組和精液參數(shù)異常不育組的HYD活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)與正常生育組相比均有明顯下降(P0.05)。相關性分析提示精子P34H蛋白表達量與arcosin活性(arcosin陽性反應率、arcosin活性強度)存在正相關性,相關系數(shù)(r=0.468,0.310;P0.01);精子P34H陽性率與arcosin活性(arcosin陽性反應率、arcosin活性強度)存在正相關性,相關系數(shù)(r=0.784,0.598;P0.01)。精子P34H蛋白表達量與HYD活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)存在正相關性,相關系數(shù)(r=0.449,0.431;P0.01);精子P34H陽性率與HYD活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)存在正相關性,相關系數(shù)(r=0.727,0.691;P0.01)。相關性分析提示精子P34H/β-actin平均光密度與精漿中性α-糖苷酶活性呈正相關性,相關系數(shù)(r=0.384,P0.01);精子P34H陽性率與精漿中性α-糖苷酶活性呈正相關性,相關系數(shù)(r=0.596,P0.01)。3.三種慢病毒干擾載體經(jīng)測序證實均已構建成功,感染小鼠附睪后,P34H mRNA及P34H蛋白的表達均明顯低于陰性感染組和正常對照組(P0.05);其中以 GV-P34H-shRNA1 作用顯著,P34H-shRNA-1感染組的P34HmRNA表達較正常對照下調為76.2%,P34H蛋白表達較正常對照下調為65.8%,精子P34H陽性表達率降低至21.71%(P0.05);而差異在陰性組和正常對照組中無統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.P34H-shRNA-1,2,3感染組的小鼠精子P34H陽性表達率、頂體反應發(fā)生率和頂體酶活性(頂體酶陽性反應率、頂體酶活性強度)均較陰性感染組和正常對照組明顯降低(P0.05);P34H-shRNA-1,2,3感染組的小鼠精子透明質酸酶(HYD)活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)和體外受精率均較陰性感染組與正常對照組明顯降低(P0.05),而差異在陰性感染組和正常對照組中無統(tǒng)計學顯著性(P0.05);均以GV-P34H-shRNA 1作用最為顯著。結論:1.精子蛋白P34HmRNA和蛋白表達在生育組和不育組中存在差異,不育患者精子P34HmRNA、P34H蛋白表達和精子P34H陽性率明顯低于正常生育組。不育患者精子P34HmRNA、P34H蛋白表達減少和精子P34H陽性率降低的同時伴隨arcosin活性(arcosin陽性反應率、arcosin活性強度)、HYD活性(HYD陽性反應率、HYD活性強度)和精漿中性α-糖苷酶活性減弱。2.精子P34H蛋白表達量和精子P34H陽性率分別與arcosin活性(arcosin陽性反應率、arcosin活性強度)、HYD活性(HYD反應陽性率、HYD活性強度)、精漿中性α-糖苷酶活性均存在正相關性。3.成功構建P34HshRNA慢病毒表達,可有效下調小鼠附睪P34HmRNA和蛋白的表達并減少小鼠精子P34H陽性表達率。4.附睪蛋白P34H基因沉默可抑制小鼠附睪中精子頂體反應率、頂體酶活性、透明質酸酶活性和體外受精率。
[Abstract]:Objective : To study the effect of P34H gene on the activity of P34H protein in human sperm , and to investigate the effect of P34H protein on the activity of P34H protein in human sperm . Results : The positive rate of P34H / 尾 - actin was significantly lower than that in normal fertile group ( P0.05 ) . The positive rate of P34H / 尾 - actin was significantly lower than that in normal fertile group ( P0.05 ) . 3 . The expression of P34HshRNA lentivirus was successfully constructed . The expression of P34HmRNA and protein in mice was reduced , and the expression rate of P34H was reduced .

【學位授予單位】：貴州醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R698.2

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本文編號：1793454