本文選題：C肽 + 大鼠腎小球系膜細(xì)胞��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是繼腫瘤、心血管疾病之后第三大非傳染性慢性疾病,嚴(yán)重威脅著人類健康。目前,全球已有3.82億人患有DM,預(yù)計(jì)到2035年將達(dá)到5.92億。我國(guó)目前DM患者已經(jīng)達(dá)到9840萬(wàn),約占全球患病人數(shù)的四分之一。據(jù)統(tǒng)計(jì),近三分之一的DM患者伴有糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)。DN是引起終末腎病的主要原因,也是DM患者的主要死亡原因。到目前為止,DN發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制尚未完全闡明,更無(wú)特效治療手段。因此,對(duì)DN發(fā)病及治療機(jī)制的研究迫切而意義重大。DN時(shí),腎小球基底膜增厚、系膜細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)成分積聚,繼而引起腎小球硬化。DN時(shí),腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)主要是Ⅳ型膠原。Ⅳ型膠原分子有6條同源性α鏈:α1(Ⅳα6(Ⅳ),分別由不同基因編碼。DN纖維化的發(fā)生發(fā)展主要依靠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor beta1,TGF-β1)途徑所調(diào)節(jié)。TGF-β1主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Smad3傳遞信號(hào),啟動(dòng)腎小球基質(zhì)的主要成份Ⅳ型膠原基因轉(zhuǎn)錄。我們的前期試驗(yàn)已證明,高糖刺激的早期反應(yīng)通過(guò)激活TGF-β1/Smad3信號(hào)通路,最終導(dǎo)致Ⅳ型膠原各α鏈基因的大量表達(dá)。C肽由Steiner等人于20世紀(jì)60年代研究胰島素合成時(shí)首次被描述,主要在脊椎動(dòng)物胰腺的胰島β細(xì)胞中產(chǎn)生。它是連接胰島素原分子中胰島素A鏈與B鏈的一種連接肽。人C肽由31個(gè)氨基酸殘基組成,其分子量為3020Da,等電點(diǎn)為3.0,半衰期為30min,主要經(jīng)腎臟代謝。正常人血清C肽的基礎(chǔ)水平約為0.4 nmol/L。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)C肽有多種生物學(xué)作用,對(duì)DM并發(fā)癥,特別是DN有明顯治療作用。Sun等的研究表明,C肽可改善DM大鼠腎小球基底膜和系膜的擴(kuò)增。臨床上也發(fā)現(xiàn)Ⅰ型DM患者做胰腺移植或胰島素-C肽聯(lián)合應(yīng)用后,腎臟病變減輕。C肽作為內(nèi)源性因子,治療DN療效獨(dú)特,具有其它外源性藥物無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì),更突顯了明確其作用機(jī)制的必要性和迫切性。DM時(shí),Ⅳ型膠原積聚是DN的直接原因。而C肽能逆轉(zhuǎn)DN的腎臟病變,提示C肽作用機(jī)制與調(diào)控Ⅳ型膠原代謝緊密相關(guān)。雖有研究表明,在DM大鼠模型體內(nèi),C肽能通過(guò)抑制DM大鼠腎小球系膜Ⅳ型膠原的形成來(lái)抑制其腎小球系膜擴(kuò)增,但其內(nèi)在分子機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討C肽是否通過(guò)抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路抑制Ⅳ型膠原基因的表達(dá),達(dá)到逆轉(zhuǎn)DN纖維化的功效。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY-1,首先應(yīng)用不同高糖來(lái)尋找模擬糖尿病高糖狀態(tài)的最佳高糖濃度;其次應(yīng)用該最佳高糖濃度作用不同時(shí)間來(lái)尋找高糖的最佳起效時(shí)間;然后應(yīng)用不同濃度C肽在同一高糖濃度及相同作用時(shí)間尋找C肽的有效濃度;用實(shí)時(shí)定量-PCR法(realtime-PCR)檢測(cè) α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、αα5(Ⅳ)以及 TGF-β1 mRNA水平變化,同時(shí)利用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞液中TGF-β1蛋白水平變化。用免疫熒光染色法觀察Smad3核轉(zhuǎn)位;利用染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)技術(shù),檢測(cè) Smad3 與 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)啟動(dòng)子的相互作用。據(jù)此,探討C肽逆轉(zhuǎn)DN纖維化的主要分子機(jī)制,為治療DN提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)還采用健康雄性SD大鼠進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),用鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)造DM模型,C肽進(jìn)行干預(yù)治療,實(shí)驗(yàn)前后測(cè)定血糖、體重變化,測(cè)定24小時(shí)尿蛋白含量,并取大鼠腎皮質(zhì)于光鏡及透射電鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,旨在進(jìn)一步探討C肽逆轉(zhuǎn)DN的整體功效及作用。方法:1細(xì)胞培養(yǎng):大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY-1,購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。HBZY-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng),0.25%胰蛋白酶消化傳代,接種于150ml培養(yǎng)瓶中,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用C肽或亂碼C肽處理HBZY-1細(xì)胞,先用高糖DMEM培養(yǎng)24小時(shí)后,再換成C肽+高糖DMEM培養(yǎng)。2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組:2.1 探討不同糖濃度 DMEM 對(duì) HBZY-1 中 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)和TGF-β1基因表達(dá)以及細(xì)胞液中TGF-β1的蛋白含量的影響用不同糖濃度DMEM培養(yǎng)HBZY-1 24小時(shí),根據(jù)不同糖濃度的DMEM分為6組:Con組(正常對(duì)照,細(xì)胞用低糖-DMEM培養(yǎng))、20mM組(細(xì)胞用含20mmol/L的葡萄糖-DMEM培養(yǎng))、25mM組(細(xì)胞用含25mmol/L的葡萄糖-DMEM培養(yǎng))、30mM組(細(xì)胞用含30mmol/L的葡萄糖-DMEM培養(yǎng))、35mM組(細(xì)胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培養(yǎng))以及40mM組(細(xì)胞用含40mmol/L的葡萄糖-DMEM培養(yǎng))。2.2 探討 35mmol/L高糖 DMEM對(duì)HBZY-1 細(xì)胞中 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)和TGF-β1基因表達(dá)以及細(xì)胞液中TGF-β1的蛋白含量的影響用35mmol/L高糖DMEM培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞,根據(jù)高糖作用時(shí)間不同分為4組:Con組(正常對(duì)照,細(xì)胞用低糖-DMEM培養(yǎng))、3h組(細(xì)胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培養(yǎng)3小時(shí))、6h組(細(xì)胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培養(yǎng)6小時(shí))、12h組(細(xì)胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培養(yǎng)12小時(shí))。2.3 探討不同濃度 C 肽對(duì) HBZY-1 細(xì)胞中 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)和TGF-β1 mRNA表達(dá)以及細(xì)胞液中TGF-β1的蛋白含量的影響根據(jù)C肽濃度不同分為6組:Con組(正常對(duì)照,細(xì)胞用低糖-DMEM培養(yǎng))、OC組(高滲對(duì)照組,細(xì)胞用含35mmol/LL構(gòu)型葡萄糖-DMEM培養(yǎng))、HG組(細(xì)胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培養(yǎng))、CP1組(0.1nmol/L C 肽+35mmol/L 高糖組)、CP5 組(0.5nmol/L C 肽+35mmol/L 高糖組)和 CP9組(0.9nmol/LC 肽+35mmol/L 高糖組)。2.4探討HBZY-1細(xì)胞中Smad3的核轉(zhuǎn)位情況根據(jù)培養(yǎng)條件不同分為7組:Con組(正常對(duì)照,細(xì)胞用低糖-DMEM培養(yǎng))、HG1組(細(xì)胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培養(yǎng)1小時(shí))、HG2組(細(xì)胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培養(yǎng)2小時(shí))、HG3組(細(xì)胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培養(yǎng)3小時(shí))、CP1組(細(xì)胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM+0.5nmol/LC肽培養(yǎng)1小時(shí))、CP2組(細(xì)胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM+0.5nmol/LC肽培養(yǎng)2小時(shí))和CP3組(細(xì)胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM+0.5nmol/LC肽培養(yǎng)3小時(shí))。2.5 探討轉(zhuǎn)錄因子 Smad3 與 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)或 α5(Ⅳ)啟動(dòng)子的相互作用實(shí)驗(yàn)分成5組:Con組(正常對(duì)照,細(xì)胞用低糖-DMEM培養(yǎng))、OC組(高滲對(duì)照組,細(xì)胞用含35mmol/L L構(gòu)型葡萄糖-DMEM培養(yǎng))、HG組(細(xì)胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM培養(yǎng))、CP組(細(xì)胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM+0.5nmol/LC肽培養(yǎng))、ScCP組(細(xì)胞用含35mmol/L的葡萄糖-DMEM+0.5nmol/L亂碼C肽培養(yǎng))。3 HBZY-1 細(xì)胞中 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)和 TGF-β1 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)Trizol 一步法分別提取HBZY-1細(xì)胞中總RNA;用β-actin做內(nèi)參,real-time PCR 方法檢測(cè) α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)及 TGF-β1的mRNA表達(dá)。4利用免疫熒光法,檢測(cè)HBZY-1細(xì)胞中Smad3的核轉(zhuǎn)位情況5 利用 ChIP 技術(shù),檢測(cè) HBZY-1 細(xì)胞中,Smad3 與 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)或α5(Ⅳ)啟動(dòng)子的相互作用6動(dòng)物分組與取材健康雄性SD大鼠80只,隨機(jī)分為2組,正常組(Con)8只,其余72只腹腔注射STZ溶液(STZ溶于濃度為0.1 mol/L的檸檬酸納緩沖液,pH 4.4,新鮮配制,終濃度為10mg/mL,按45mg/kg腹腔注射)制備DM模型。注射3天后,測(cè)空腹血糖高于16.7mmol/L,尿糖+++以上,為造模成功。造模成功68只,再將其隨機(jī)分成4組:病理組(DM,17只),C肽防治組,C肽治療組(CP,17只),亂碼C肽治療組(ScCP,17只)。以上五組均20～25℃室溫下喂養(yǎng)。DP組每天兩次皮下注射C肽(130nmol/kg),治療6周后停藥。CP組和ScCP組在病程6周后,分別開(kāi)始每天兩次皮下注射人C肽或亂碼C肽(130nmol/kg),治療6周。最后股動(dòng)脈放血處死。6.1檢測(cè)血糖和24小時(shí)尿白蛋白含量取尾靜脈血,用血糖儀檢測(cè)并記錄注射STZ前、后第3天和第12周的血糖變化。收集24小時(shí)尿液,檢測(cè)尿白蛋白含量。6.2形態(tài)學(xué)觀察取腎皮質(zhì)作病理切片,分別于光鏡和透射電鏡下觀察。結(jié)果:1 realtime-PCR 檢測(cè)不同糖濃度 DMEM 對(duì) HBZY-1 中 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)和 TGF-β1mRNA 表達(dá)1.1 α1(Ⅳ)mRNA的相對(duì)表達(dá)量與Con組比20mM組(2.25 ± 0.12,P0.05)、25mM 組(2.69 ±0.19,P0.01)、30mM 組(2.51±0.10,P0.01)、35mM 組(4.02 ± 0.52,P0.01)以及 40mM 組(3.20 ± 0.36,P0.01)均顯著升高。1.2 α2(Ⅳ)mRNA的相對(duì)表達(dá)量與Con組比20mM組(2.98 ± 0.22,P0.01)、25mM 組(2.57 ±0.38,P0.05)、30mM 組(2.57 ± 0.30,P0.05)、35mmol/L 組(4.28 ±0.54,P0.01)以及 40mM 組(2.40 ± 0.32,P0.05)均顯著升高。1.3 α3(Ⅳ)mRNA的相對(duì)表達(dá)量與Con組比20mM組(2.42 ± 0.10,P0.05)、25mM 組(2.54 ±0.29,P0.01)、30mM 組(2.58 ±0.27,P0.01)、35mM 組(3.84 ± 0.32,P0.01)以及 40mM 組(2.59 ± 0.40,P0.01)均顯著升高。1.4 α4(Ⅳ)mRNA的相對(duì)表達(dá)量與Con組比20mM組(3.33 ± 0.16,P0.01)、25mM 組(3.39 ±0.25,P0.01)、30mM 組(3.32 ±0.44,P0.01)、35mM 組(4.68 ± 0.44,P0.01)以及 40mM 組(3.50 ± 0.22,P0.01)均顯著升高。1.5 α5(Ⅳ)mRNA的相對(duì)表達(dá)量與Con組比20mM組(2.13 ± 0.15,P0.01)、25mM 組(2.31 ±0.09,P 0.01)、30mM 組(2.17 ±0.05,P0.01)、35mM 組(3.39 ± 0.05,P0.01)以及 40mM 組(2.192 ± 0.09,P0.01)均顯著升高。1.6 TGF-β1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與Con組比20mM組(3.10 ± 0.29,P0.01)、25mM組(3.14±0.14,P0.01)、30mM組(2.78±0.32,P0.01)、35mM 組(3.76 ± 0.27,P0.01)以及 40mM 組(2.84 ± 0.14,P0.01)均顯著升高。2realtime-PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)35mmol/L高糖DMEM對(duì)HBZY-1細(xì)胞中α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)和 TGF-β1mRNA 表達(dá)的影響2.1 α1(Ⅳ)mRNA 的相對(duì)表達(dá)量與 Con 組比 3h 組(4.63 ± 0.61,P0.01)、6h 組(2.48 ± 0.26,P0.05)、12h 組(2.86 ± 0.17,P0.01)均顯著升高。2.2 α2(Ⅳ)mRNA 的相對(duì)表達(dá)量與 Con 組比 3h 組(2.97 ± 0.05,P0.05)、6h 組(2.43 ± 0.13,P0.01)、12h 組(2.66 ± 0.12,P0.01)均顯著升高。2.3 α3(Ⅳ)mRNA 的相對(duì)表達(dá)量與 Con 組比 3h 組(4.00 ± 0.56,P ＜ 0.01)、6h 組(3.05 ± 0.49,P0.01)、12h 組(3.07 ± 0.50,P0.01)均顯著升高。2.4 α4(Ⅳ)mRNA 的相對(duì)表達(dá)量與 Con 組比 3h 組(2.94 ± 0.82,P0.01)、6h 組(2.13 ± 0.07,P0.01)、12h 組(2.44 ± 0.07,P0.01)均顯著升高。2.5 HBZY-1中α5(Ⅳ)mRNA的相對(duì)表達(dá)量與(Con組比3h組(3.41±0.16,P0.01)、6h組(2.40±0.11,P0.01)、12h組(2.42±0.06,P0.01)均顯著升高。2.6 TGF-β1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量與 Con 組比 3h 組(4.00 ± 0.56,P0.01)、6h 組(3.05 ± 0.49,P0.05)、12h 組(3.07 ± 0.50,P0.05)均顯著升高。3 realtime-PCR 檢測(cè)不同濃度 C 肽對(duì) HBZY-1 細(xì)胞中 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)、α5(Ⅳ)和 TGF-β1mRNA 表達(dá)的影響3.1 α1(Ⅳ)mRNA的相對(duì)表達(dá)量與Con組比OC組(1.16 ± 0.11)、CP5組(1.18 ± 0.16)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而與Con組比HG組(3.59 ± 0.57,P0.01)、CP1 組(3.59±0.57,P0.01)、CP9組(3.82±0.55,P0.01)均顯著升高。3.2 α2(Ⅳ)mRNA 的相對(duì)表達(dá)量與 Con 組比 OC 組(0.96 ± 0.10)、CP5(0.92±0.12)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而與Con組比HG組(3.12 ±0.48,P0.01)、CP1組(2.53 ± 0.28,P0.01)、CP9 組(2.25 ± 0.28,P0.05)均顯著升高。3.3 α3(Ⅳ)mRNA的相對(duì)表達(dá)量與Con組比OC組(0.85 ± 0.07)、CP5組(1.04 ± 0.13)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而與Con組比HG組(2.67 ± 0.45,P0.05)、CP1 組(2.46 ± 0.52,P0.05)、CP9 組(2.42 ± 0.40,P0.05)均顯著升高。3.4 α4(Ⅳ)mRNA的相對(duì)表達(dá)量與Con組比OC組(1.10 ± 0.12)、CP5組(1.12 ± 0.10)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而與 Con 組比 HG 組(2.18 ± 0.18,P0.01)、CP1 組(2.22 ± 0.15,P0.01)、CP9 組(2.26 ± 0.15,P0.01)均顯著升高。3.5 α5(Ⅳ)mRNA的相對(duì)表達(dá)量與Con組比OC組(1.05 ± 0.06)、CP5組(1.08 ± 0.07)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而與Con組比HG組(2.30 ± 0.07,P0.01)、CP1 組(1.71 ± 0.05,P0.01)、CP9 組(2.04 ± 0.11,P0.01)均顯著升高。3.6 TGF-β1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與Con組比OC組(1.04 ± 0.07)、CP5組(1.06 ± 0.14)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而與Con組比HG組(2.90 ± 0.09,P0.01)、CP1 組(2.04 ± 0.13,P0.01)、CP9 組(2.21 ± 0.21,P0.01)均顯著升高。4 ELISA檢測(cè)不同糖濃度DMEM對(duì)HBZY-1細(xì)胞液中TGF-β1蛋白含量的影響。與 Con 組(506.60 ± 37.44 pg/ml)比 20mM 組(485.55 ± 12.49 pg/ml)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而 25mM 組(364.12 ± 18.12 pg/ml,P ＜ 0.01)、30mM 組(385.25 ± 20.42 pg/ml,P ＜ 0.01)、35mM 組(307.29 ± 6.66 pg/ml,P ＜ 0.01)以及 40mM 組(352.22±14.98 pg/ml,P＜0.01)均顯著降低。5 ELISA檢測(cè)35mmol/L高糖DMEM,不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HBZY-1細(xì)胞液中TGF-β1 蛋白含量的影響。與 Con 組(798.972± 37.367pg/ml)比 3h 組(322.77± 22.52 pg/ml,P ＜ 0.01)、6h 組(447.69 ± 47.68 pg/ml,P ＜ 0.01)均顯著降低;而12h組(738.40 ± 64.53 pg/ml)卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。6 ELISA檢測(cè)不同濃度C肽對(duì)細(xì)胞液中TGF-β1蛋白含量的影響。與Con組(1228.90 ± 57.79 pg/ml)比 OC 組(1198.99 ± 26.14 pg/ml)、CP5 組(1197.19± 13.75 pg/ml)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而 HG 組(1036.07 ± 55.64 pg/ml,P ＜ 0.05)、CP1 組(1365.66 ± 45.84 pg/ml,P ＜ 0.05)以及 CP9 組(1459.49 ± 45.52 pg/ml,P0.05)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。7免疫熒光法檢測(cè)HBZY-1細(xì)胞核中Smad3的核轉(zhuǎn)位情況。正常組細(xì)胞在3h內(nèi)均未檢測(cè)到Smad3熒光;HG1組及HG2組檢測(cè)到部分Smad3熒光;HG3組Smad3熒光強(qiáng)度最為顯著,Smad3蛋白幾乎全都進(jìn)核。CP1組和CP2組檢測(cè)到Smad3熒光;CP3組Smad3熒光最弱,Smad3蛋白幾乎都已出核。8 ChIP 技術(shù)檢測(cè) HBZY-1 細(xì)胞內(nèi) Smad3 與 α1(Ⅳ)、α2(Ⅳ)、α3(Ⅳ)、α4(Ⅳ)或α5(Ⅳ)各啟動(dòng)子的相互作用的變化。8.1與Con組比Smad3與α1(Ⅳ)和α2(Ⅳ)啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合作用OC組(1.08± 0.11)、CP 組(1.18 ± 0.11)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而 HG 組(2.58 ± 0.21,P0.01)、ScCP 組(2.04 ± 0.12,P ＜ 0.01)均顯著升高。8.2與Con組比Smad3與α3(Ⅳ)及α4(Ⅳ)啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合作用OC組(1.16± 0.06)、CP 組(1.41 ± 0.26)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而 HG 組(109.33 ± 2.85,P0.01)、ScCP 組(66.09 ± 6.51,P0.01)均顯著升高。8.3與Con組比Smad3與α5(Ⅳ)啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合作用OC組(1.23 ± 0.17)、CP 組(1.59 ± 0.15)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而 HG 組(13.08 ± 0.83,P0.05)、ScCP組(10.26 ± 0.90,P0.05)均顯著升高。9大鼠的一般表現(xiàn)以及C肽對(duì)DM大鼠血糖和體重的影響造模成功的大鼠逐漸出現(xiàn)消瘦,皮毛無(wú)光澤、疏松,反應(yīng)遲鈍,多飲、多尿、多食、生長(zhǎng)遲緩等癥狀。隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行,DM組和ScCP組體征更加明顯,而DP組和CP組明顯有好轉(zhuǎn)。各組大鼠入選時(shí)血糖和體重?zé)o顯著性差異。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中,DP組平均血糖(29.96±0.52mmol/L),CP組(28.9±0.74mmol/L),ScCP組(29.74±0.66mmol/L),均與DM組(29.23 ± 0.66mmol/L)無(wú)顯著性差異。以上四組均顯著高于 Con 組(6.4 ± 0.25 mmol/L,P0.01)。藥物干預(yù)治療結(jié)束時(shí),CP組體重(271.82 ±8.76 g),ScCP組(248.35 ±7.19 g),DP 組體重(368.06 ±10.09 g),均與 DM 組(249.00 ±7.13 g)無(wú)顯著性差異。以上四組均顯著低于Con組(515.50 ± 14.42 g,P0.01)。10尿白蛋白含量的變化整個(gè)實(shí)驗(yàn)中,DP 組(55.21 ± 4.06 mg)及 CP 組(70.2 ± 9.46 mg)平均 24小時(shí)尿白蛋白含量均顯著低于DM組(327.93 ± 32.58 mg,P0.05);ScCP組(293.79 ± 49.40 mg)平均24小時(shí)尿白蛋白含量與DM組無(wú)顯著性差異。以上四組均顯著高于Con組(15.42 ± 4.06 mg,P＜ 0.01)。11腎小球形態(tài)學(xué)觀察腎小球光鏡(×400)下觀察:Con組腎小球未見(jiàn)異常;DM組,可見(jiàn)腎小球結(jié)構(gòu)異常、腎小囊腔增大;ScCP組與DM組相似,并且有腎小球壞死的現(xiàn)象;而DP組和CP組,可見(jiàn)腎小囊腔縮小,與DM組比有所改善,且DP組較CP組的病理改變減輕。腎小球透射電鏡(×20K)下觀察:Con腎小球未見(jiàn)異常。DM組,可見(jiàn)基底膜重度增厚,呈丘狀隆起,足突重度融合,血管內(nèi)皮細(xì)胞重度增生,窗孔加減少;ScCP組與DM組相似;DP組和CP組可見(jiàn)基底膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞接近正常,足突部分輕度融合,與DM組比明顯改善,且DP組較CP組的病理改變減輕。結(jié)論:1 C肽調(diào)控Ⅳ型膠原表達(dá)逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病纖維化的分子機(jī)制是:(1)C肽可明顯抑制高糖(35mmol/L)引起的系膜細(xì)胞Ⅳ型膠原各α鏈以及TGF-β1過(guò)表達(dá),其抑制強(qiáng)度以0.5nmol/LC肽濃度最為顯著,且該抑制作用不隨C肽濃度增大而增強(qiáng)。(2)C肽通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子Smad3與Ⅳ型膠原各α鏈啟動(dòng)子相互作用抑制Ⅳ型膠原各α鏈基因的表達(dá)。2 C肽能改善DM大鼠腎小球的形態(tài)學(xué)變化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R587.2;R692.9

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 霍艷英 ,張開(kāi)泰 ,李邦印 ,段瑞峰 ,范保星 ,項(xiàng)小瓊 ,胡迎春 ,謝玲 ,吳德昌;RESPONSIVENESS OF Smad7 GENE TO TGF-b1 IN THE TUMORIGENESIS[J];Chinese Journal of Cancer Research;2002年03期

2 陳偉 ,付小兵 ,盛志勇;Review of current progress in the structure and function of Smad proteins[J];Chinese Medical Journal;2002年03期

3 王啟偉;Smad蛋白信號(hào)網(wǎng)絡(luò)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));2003年04期

4 張遠(yuǎn)強(qiáng),胡靜,劉新平,許若軍;EXPRESSION AND LOCALIZATION OF SMAD4 PROTEIN IN RAT TESTIS DURING THE POSTNATAL DEVELOPMENT[J];Chinese Medical Sciences Journal;2003年03期

5 徐新保,冷希圣,何振平,梁志清,林凱,魏玉華,于鑫,彭吉潤(rùn);Inhibitory effect of retroviral vector containing anti-sense Smad_4 gene on Ito cell line, LI90[J];Chinese Medical Journal;2004年08期

6 鄭啟新;王運(yùn)濤;郭曉東;;Wild-type Smad3 Gene Enhances the Osteoblastic Differentiation of Rat Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells in Vitro[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)英德文版);2005年06期

7 王運(yùn)濤,鄭啟新,郭曉東,吳永超,郝杰;Influence of Exogenous TGFβ_1 on the Expression of Smad2 and Smad3 in Rat Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)英德文版);2005年01期

8 ;HSP70 decreases receptor-dependent phosphorylation of Smad2 and blocks TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition[J];遺傳學(xué)報(bào);2011年03期

9 ;Berbamine inhibits proliferation and induces apoptosis of KU812 cells by increasing Smad3 activity[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2011年07期

10 尚政軍;修復(fù)相關(guān)基因Smad3的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));2001年05期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 霍艷英;李剛;胡迎春;周平坤;吳德昌;;THE SIGNIFICANCE OF SMAD7 IN TGF-β-MEDIATED SMADS AND ERK/MAPK SIGNAL PATHWAY IN RADIATION-INDUCED TUMORIGENIC HUMAN BRONCHIAL EPITHELIAL CELLS[A];海峽兩岸第三屆毒理學(xué)研討會(huì)論文摘要[C];2005年

2 張素平;張然;陳峰;張麗霞;陳曄光;;Smad7 antagonises TGF-β signaling in the nucleus[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)2005年學(xué)術(shù)大會(huì)、青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2005年

3 王劍;楊曉;;Gene expression profile in cardiomyocyte-specific Smad4 knock-out mice[A];中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)第八次代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

4 劉昭廷;王強(qiáng);孟安明;;基因組水平上受斑馬魚(yú)Smad2調(diào)控的靶基因[A];“細(xì)胞活動(dòng) 生命活力”——中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)全體會(huì)員代表大會(huì)暨第十二次學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2011年

5 ;HSP70 decreases receptor-dependent phosphorylation of Smad2 and blocks TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition[A];“細(xì)胞活動(dòng) 生命活力”——中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)全體會(huì)員代表大會(huì)暨第十二次學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2011年

6 ;Maternal Smad3 Deficiency Compromises Decidualization in Mice[A];“細(xì)胞活動(dòng) 生命活力”——中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)全體會(huì)員代表大會(huì)暨第十二次學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2011年

7 Jingmin Zhao;Jia Wang;Jun Yu;;Inhibitory role of Smad7 in hepatocarcinogenesis in mice and in vitro[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十六次全國(guó)病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2013年

8 Bensoussan D.;Stoltz J.F.;de Isla N;;Differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells induced by biaxial tension involves Smad3 activation[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)第23屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨生理學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要文集[C];2010年

9 ;Function of TGF-β/Smad4 Signaling in the Maintenance of Tissue Homeostasis[A];中國(guó)的遺傳學(xué)研究——遺傳學(xué)進(jìn)步推動(dòng)中國(guó)西部經(jīng)濟(jì)與社會(huì)發(fā)展——2011年中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)大會(huì)論文摘要匯編[C];2011年

10 楊曉;;Targeted disruption of Smad4 in mouse epidemis results in failure of hair follicle cycling and formation of skin tumors[A];中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)七屆一次青年研討會(huì)暨上海高校模式生物E——研究院第一屆模式生物學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2005年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 本報(bào)記者 向佳;糖尿病中醫(yī)藥防治項(xiàng)目立足社區(qū)[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2011年

2 特約記者 魯海燕;逾八成公眾存在糖尿病高危因素[N];家庭醫(yī)生報(bào);2013年

3 馬明愈;現(xiàn)代生活方式導(dǎo)致 糖尿病發(fā)病率迅速上升[N];中國(guó)婦女報(bào);2005年

4 省立醫(yī)院內(nèi)分泌科主任醫(yī)師 侯建明;糖尿病腎病的防治[N];福建科技報(bào);2004年

5 王文絹 范軍星;世界糖尿病日關(guān)注焦點(diǎn):糖尿病并發(fā)癥[N];健康報(bào);2003年

6 主持人 向紅丁博士;糖尿病腎病須早防早治[N];人民政協(xié)報(bào);2002年

7 華悅;預(yù)防糖尿病，，從減肥開(kāi)始[N];上海中醫(yī)藥報(bào);2004年

8 劉冬梅;肥胖糖尿病第一誘因[N];天津日?qǐng)?bào);2004年

9 劉燕玲;首部中醫(yī)專病指南定下糖尿病治則[N];健康報(bào);2007年

10 崔昕;中藥防治糖尿病腎病有進(jìn)展[N];健康時(shí)報(bào);2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 黎錦;氨氯地平通過(guò)調(diào)節(jié)Smad的表達(dá)防止腎臟纖維化[D];武漢大學(xué);2014年

2 張俊文;TGF-β信號(hào)通路中兩個(gè)與TβRI相互作用蛋白的功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2012年

3 胡祥鵬;復(fù)方芪參提取物調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)及miR-145、miR-21表達(dá)發(fā)揮抗肝纖維化—肝細(xì)胞癌作用[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

4 徐濤;NLRC5通過(guò)NF-κB與TGF-β1/Smad通路調(diào)控肝星狀細(xì)胞炎癥因子分泌和纖維化的功能及其機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

5 徐洪杰;回轉(zhuǎn)條件下成骨細(xì)胞微絲對(duì)BMP2信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控[D];西北工業(yè)大學(xué);2015年

6 黃闖;FTY-720調(diào)節(jié)去勢(shì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化Smad信號(hào)通路的機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

7 王加紅;IL-6對(duì)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路介導(dǎo)缺血心肌重構(gòu)的影響及作用機(jī)制[D];山東大學(xué);2015年

8 田彥;三步序貫法對(duì)激素依賴型哮喘患者及激素撤減過(guò)程中氣道重塑模型大鼠TGF-β_1/Smad信號(hào)通路的影響[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2016年

9 計(jì)磊;突變體p53與生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子β信號(hào)在肺癌發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中的作用[D];華東師范大學(xué);2015年

10 牛立慢;TGF-β1/Smad3在四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷中的表達(dá)及其作用研究[D];吉林大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 鐘艷;C肽調(diào)控Ⅳ型膠原表達(dá)逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病纖維化的分子機(jī)制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

2 林琳;SnoN蛋白在RPE細(xì)胞TGF-β/Smad信號(hào)通路中的作用[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

3 丁雪峰;芪藶強(qiáng)心提取物阻斷Smad3信號(hào)通路抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的機(jī)制研究[D];川北醫(yī)學(xué)院;2015年

4 李祥亭;N-乙酰半胱氨酸對(duì)大鼠肺纖維化模型肺組織Smad家族基因表達(dá)的影響[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2015年

5 李鑫靜;Smad4、Kindlin-2和Anxa2基因在胃癌組織中的表達(dá)及臨床病理意義[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

6 汪呈;靶向Smurf1 HECT結(jié)構(gòu)域的小分子抑制劑的細(xì)胞學(xué)水平驗(yàn)證[D];石河子大學(xué);2015年

7 田茜華;補(bǔ)腎法、疏肝法對(duì)體外培養(yǎng)IVF-ET患者卵巢顆粒細(xì)胞中ACTA及其Smads信號(hào)通路的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

8 李春杰;新生大鼠高氧性肺損傷肺組織中Smad3及PPAR-γ的蛋白和mRNA表達(dá)及羅格列酮的干預(yù)作用[D];蘇州大學(xué);2015年

9 孫景英;CXCL9和Smad3的表達(dá)與新疆維吾爾族銀屑病發(fā)病關(guān)系的研究[D];石河子大學(xué);2015年

10 黃海平;MiR-145通過(guò)靶向作用于Smad3抑制鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[D];蘇州大學(xué);2015年

本文編號(hào)：1761581