本文選題：腎細胞癌(RCC) + 代謝組學　； 參考：《南方醫(yī)科大學》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景和意義 腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,僅次于膀胱癌和前列腺癌,占腎臟惡性腫瘤的80-90%。腎細胞癌起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤,又稱腎腺癌,簡稱腎癌,包括起源于泌尿小管不同部位的各種腎細胞亞型,RCC與腎小管上皮細胞病變相關(guān)。流行病學調(diào)查顯示腎癌約占成人惡性腫瘤的2%-3%,,各國和各地區(qū)的發(fā)病率不同,發(fā)達國家發(fā)病率及死亡率高于發(fā)展中國家,我國各地區(qū)腎癌的發(fā)病率和死亡率差異也較大。RCC可發(fā)生于各個年齡段,高發(fā)年齡為50-70歲,男女之比值約為2：1。RCC的病理分類較多,共有10類,其中腎透明細胞癌(clear cell renal cancer, ccRCC)是最常見的。RCC的發(fā)病因素目前還不清楚,起病隱匿,早期缺乏特征性的癥狀體征,經(jīng)典血尿、腰痛、腹部腫塊“腎癌三聯(lián)征”臨床出現(xiàn)率不到15%。臨床診斷缺乏可靠的實驗室診斷指標,主要靠影像學檢查,確診需依靠病理學檢查,RCC的早期診斷手段的缺乏使得早發(fā)現(xiàn)早治療具有一定的困難。因RCC的多重耐藥性和生物學特性,對放化療及激素治療均不敏感,手術(shù)治療被認為是唯一可以治愈早期腎癌的方法,因此RCC的早期診斷仍是當前很多醫(yī)學工作者研究的重點。目前一種新的利用高分辨率分析技術(shù)分析樣品中系列小分子的代謝物圖譜,進而篩選差異代謝產(chǎn)物作為標志代謝物的的方法引起了廣泛的興趣。 代謝組學(metabolomics)是繼基因組學,蛋白質(zhì)組學之后興起的系統(tǒng)生物學的一個新的分支。代謝組(metabonome)指一個細胞、組織或器官中所有代謝組分,尤指小分子物質(zhì),而代謝組學則是一門在新陳代謝的動態(tài)過程中,生物體(從細胞到整體生物)受刺激或紊亂前后(如將某個特定的基因變異或環(huán)境改變后)其代謝產(chǎn)物種類、數(shù)量及其變化規(guī)律,揭示機體生命活動代謝本質(zhì)的科學。代謝組學研究的關(guān)鍵在于研究這些因內(nèi)源性或外源性的刺激所引起的終端大量小分子代謝產(chǎn)物(主要是相對分子質(zhì)量在1000以下的內(nèi)源性小分子)的變化規(guī)律,進行快速、準確的分析鑒定,全面動態(tài)地揭示生理或病理狀態(tài)下生物體對外界的應(yīng)答反應(yīng)變化過程,為了解RCC的發(fā)生機制提供一個新視角。聯(lián)合細胞代謝組學和RCC患者體液代謝組學研究,能得到更多的疾病相關(guān)信息,有利于RCC的早期診斷。此外,本次研究的臨床樣本采用的是尿液樣本,采集過程方便、無創(chuàng)無輻射,利于大規(guī)模的體檢篩查。 研究目的 建立基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的腎癌細胞培養(yǎng)上清和RCC患者尿液的代謝組學研究方法,建立數(shù)據(jù)模型,篩選RCC特異性代謝標志物并加以驗證,為臨床RCC的早期診斷提供新的診斷標志分子。 研究方法： 1.細胞培養(yǎng) 人腎透明細胞癌細胞786-0和HK-2細胞的培養(yǎng)按照常規(guī)的細胞培養(yǎng)方法,培養(yǎng)基質(zhì)為含10%小牛血清的DMEM,置于37℃恒溫、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每24h用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況,每2-3天用胰酶消化、傳代培養(yǎng),取生長狀態(tài)良好的細胞用于實驗。 2.制作細胞生長曲線 細胞計數(shù)法測定786-0細胞及HK-2細胞的生長曲線按每孔0.5×104/mL細胞密度分別接種于24孔板中,培養(yǎng)條件如上。24h后計數(shù),以后每隔24h計數(shù)一次,每次各取3孔細胞,分別計數(shù),每孔重復三次,取其平均值。連續(xù)計數(shù)7d。根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果,以單位細胞數(shù)(細胞數(shù)/mL)為縱坐標,以培養(yǎng)時間為橫坐標繪制生長曲線。 3.代謝組學樣本采集、前處理及GC-MS檢測體系的建立 細胞水平的分析采用48h培養(yǎng)上清；臨床樣本收集27例RCC患者、26例泌尿系其它腫瘤及26例健康對照者的尿液標本。細胞上清采用含1%三甲基氯硅烷(trimethylchlorosilane,TMCS)的N-O-X2(三甲基硅基)三氟乙酰胺(trimethyl silane-N-O-double (three methyl silicon alkyl) fluoroacetamide,BSTFA)進行衍生化,尿液采用氯甲酸乙酯(ethyl chloroformate, ECF)衍生化,然后進行GC-MS分析。該部分內(nèi)容包括：(1)樣本的前處理過程,含細胞培養(yǎng)上清及尿液的衍生化兩種樣本處理過程各相關(guān)影響因素的優(yōu)化；(2)GC-MS分析條件的優(yōu)化(電壓、載氣流速、是否分流及分流比、升溫程序等)。 4.數(shù)據(jù)分析,建立數(shù)據(jù)模型,篩選差異性代謝產(chǎn)物 GC-MS分析之后產(chǎn)生海量的數(shù)據(jù),為了充分獲得GC-MS數(shù)據(jù)中的代謝物信息,對代謝組學中的數(shù)據(jù)分析主要采用化學計量學的方法,主要包括：(1)數(shù)據(jù)提取,利用XCMS等商業(yè)化的軟件進行峰識別和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化；(2)進行背景扣除、濾噪、保留時間校正、譜峰匹配和歸一化等數(shù)據(jù)前處理,以消除干擾因素的影響,增加數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性；(3)模式識別,利用SIMCA-P等類似的軟件進行多變量分析,并通過總結(jié)、分類及判別分析建立相應(yīng)的數(shù)學模型,如主成分分析(PCA)和最小乘法判別分析(PLS-DA),發(fā)現(xiàn)能有效表征RCC和對照組中細胞上清和尿液中主要差異性代謝物。 5.譜庫檢索 每個樣品獲得總離子流圖后,利用儀器自帶的NIST2011質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對全部代謝物進行鑒定,結(jié)合Scripps Center for Metabolomics (http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php)和HMDB數(shù)據(jù)庫(http://www.hmdb.ca/),鑒定內(nèi)源性生物標志物,選擇匹配度較高的內(nèi)源性生物標志物作為鑒定結(jié)果。 研究結(jié)果 1.生長曲線表明,786-0細胞與HK-2細胞的生長速度相似,兩種細胞都是從第2天開始進入對數(shù)期,在第4天進入平臺期。細胞數(shù)目統(tǒng)計表明,在培養(yǎng)48h后,786-0細胞和HK-2細胞的細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。 2.應(yīng)用BSTFA和GC-MS分析786-0細胞與HK-2細胞的培養(yǎng)上清,建立其相應(yīng)的儀器分析方法。應(yīng)用自動峰識別程序和安捷倫7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀自帶的NIST11.L進行譜庫檢索,實驗共發(fā)現(xiàn)81個代謝物,其中匹配度高于80的代謝產(chǎn)物有48個,主要是氨基酸、糖類、有機小分子酸類以及胺類等。 3.獲得的數(shù)據(jù)首先用非監(jiān)督的PCA進行比較,結(jié)果表明3個主成分的累積解釋率R2Xcum=0.847, Score Plot得分圖顯示,786-0細胞和HK-2細胞在PC1的維和PC2維上有良好的分離趨勢,表明腎小管的腫瘤細胞和良性細胞的代謝模式存在明顯差異。 4.運用有監(jiān)督的PLS-DA的方法對786-0組及HK-2組的細胞培養(yǎng)上清數(shù)據(jù)進行建模,進一步驗證分類結(jié)果的可靠性,該模型有較高的解釋率及預(yù)測率(R2Xcum=0.809, R2Ycum=0.99, Q2Ycum=0.935)。 Score Plot得分圖清晰顯示,786-0細胞的樣本點分散在左側(cè),而HK-2細胞分散在右側(cè),表明兩種細胞的代謝模式存在差異,與PCA的結(jié)果相一致。 5.通過尋找對區(qū)分786-0組及HK-2組代謝差異貢獻較大的變量,本次實驗共篩選出11種代謝產(chǎn)物,主要是氨基酸和糖等,它們分別是：絲氨酸、甘氨酸、N-乙酰-L-賴氨酸、蘇氨酸、葡萄糖、2-丙烯酸、色氨酸、呋喃果糖、焦谷氨酸、L-巖藻糖和甘露醇,主要與氨基酸代謝和能量代謝有關(guān)。除甘露醇外,其它代謝物在786-0細胞上清中的水平均顯著低于HK-2細胞(p0.001)。 6.應(yīng)用ECF衍生化和GC-MS分析技術(shù)建立尿液分析方法,本次實驗共發(fā)現(xiàn)119個代謝物,主要有氨基酸類、脂肪酸類、有機小分子酸類及胺類物質(zhì)等。 7.RCC組、TC組和HC組的PCA結(jié)果顯示,主成分累計解釋率為R2Xcum=0.846,Q2cum=0.575, Score Plot得分圖顯示各組分離趨勢較好,但有離群點,需進一步分析。 8.采用OPLS-DA的三組樣本進行分析,并篩選差異變量。該模型有較高的解釋率及預(yù)測率(R2Xcum=0.736,R2Ycum=0.974, Q2Ycum=0.897),但對區(qū)分病理類型效果不理想。本實驗共篩選出14種代謝產(chǎn)物,分別是硬脂酸、苯丙氨酸、色氨酸、馬尿酸、賴氨酸、吲哚乙酸、苯基丙二酸、丙二酸、戊酸、戊二酸、己二酸、6-甲氧基-硝基喹啉和氨基喹啉、喹啉。對篩選出物質(zhì)進行t檢驗,結(jié)果顯示,RCC組與健康對照組相比,其戊酸、丙二酸、戊二酸、己二酸、吲哚乙酸、氨基喹啉及喹啉在尿液中的含量比正常人高(p0.01),而戊酸、苯丙氨酸、6-甲氧基-硝基喹啉及色氨酸在尿液中含量則比泌尿系其它腫瘤的含量高(p0.01)。 結(jié)論 1.基于三甲基硅烷化衍生的GC/MS分析適用于細胞培養(yǎng)上清的代謝組學研究,能準確區(qū)分腎癌細胞和良性細胞。 2.基于ECF衍生的GC/MS分析適合于臨床RCC患者的尿液代謝組學研究,能夠準確區(qū)分健康對照組和腎癌患者的尿液。 3.本研究篩選出的差異代謝產(chǎn)物有可能是表征腎細胞癌的潛在的生物標志物。
[Abstract]:Background and significance of research

Renal cell carcinoma ( RCC ) is one of the most common malignant tumors in urinary system . It is only secondary to bladder cancer and prostate cancer , accounting for 80 - 90 % of renal malignant tumor .

metabolomics is a new branch of systemic biology following genomics and Proteomics . metabolomics is a new branch of metabolism in cells , tissues or organs , especially small molecule substances .

Purpose of study

To establish a new diagnostic marker molecule for the early diagnosis of RCC by establishing a data model , screening RCC - specific metabolic markers and verifying the urine of RCC patients by GC - MS .

Study method :

1 . Cell culture

Human renal clear cell 786 - 0 and HK - 2 cells were cultured in DMEM containing 10 % calf serum in DMEM containing 10 % calf serum , cultured in incubator at 37 鈩，

本文編號：1753215