本文選題：前列腺癌 + ELL2　； 參考：《鄭州大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景和目的前列腺癌是男性發(fā)病率第二的腫瘤,僅次于第一位的肺癌,其死亡率在男性惡性腫瘤中排第五位。近二十年來(lái),中國(guó)前列腺癌的發(fā)病率明顯升高。雖然前列腺癌在診療上取得了很大進(jìn)展,但是,臨床工作中關(guān)于前列腺癌的惡性程度與預(yù)后判斷缺乏有效的檢測(cè)指標(biāo),而且,多數(shù)患者在歷經(jīng)一段有效的雄激素阻斷治療階段后,最終演變?yōu)槿?shì)抵抗性前列腺癌,目前的治療方法效果有限,如何控制雄激素非依賴前列腺癌進(jìn)展,是泌尿系腫瘤領(lǐng)域眾所周知的難題。ELL2(eleven-nineteen lysine-rich leukemia 2)是ELL家族中重要的一員,作為SEC(super elongation complex)超級(jí)延伸復(fù)合體的主要成分,它與結(jié)合因子EAF1(ELL-associated factor 1)、EAF2(ELL-associated factor 2)等共同形成超級(jí)延伸復(fù)合體,作用于RNA聚合酶II,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄延伸速度。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)異常是人類諸多疾病的原因,該領(lǐng)域是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。ELL2作為ELL蛋白家族中的一員,與ELL類似,它同樣可結(jié)合RNA聚合II,加快轉(zhuǎn)錄延伸速度,但ELL2表達(dá)或功能的異常是否同樣參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,目前尚未見(jiàn)報(bào)道。腫瘤的發(fā)生是多種致病因子共同作用的結(jié)果,其中重要的一點(diǎn)是細(xì)胞脫離正常生長(zhǎng)周期的調(diào)控,表現(xiàn)為過(guò)度增殖傾向,而且,腫瘤細(xì)胞逃逸正常免疫系統(tǒng)的監(jiān)視,其程序性死亡(凋亡)的調(diào)控出現(xiàn)異常,呈現(xiàn)出永生化傾向。細(xì)胞凋亡率降低是腫瘤形成和發(fā)展的重要因素之一,調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的主要有以下兩條:細(xì)胞外死亡誘導(dǎo)信號(hào)如Fas配體和Fas受體信號(hào)通路以及細(xì)胞內(nèi)固有的凋亡通路(即程序性細(xì)胞死亡通路)。兩者最終都通過(guò)激活胞內(nèi)休眠的蛋白酶起作用,如caspase蛋白家族。前期的研究發(fā)現(xiàn),在前列腺增生組織中,ELL2表達(dá)水平上調(diào),但是,ELL2是否對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖與凋亡有調(diào)控作用,尚不十分清楚。造成前列腺癌的預(yù)后不良的另外一個(gè)原因是其轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的過(guò)程中,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)起著主要作用,MMPs可以降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),提高腫瘤細(xì)胞的侵襲力,尤其是MMP1、MMP2、MMP3和MMP9等。此外,細(xì)胞黏附分子,如細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-cadherin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)等在腫瘤細(xì)胞遷移中也起一定作用。ELL2對(duì)于前列腺癌細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響也有待于實(shí)驗(yàn)證實(shí)。真核細(xì)胞內(nèi)的大多數(shù)蛋白質(zhì)通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解,泛素化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的過(guò)程,對(duì)蛋白活化、濃度調(diào)節(jié)、降解都發(fā)揮重要作用,如果需要上調(diào)靶蛋白水平,阻止其泛素化降解是一種重要方法。每個(gè)蛋白都在特定的賴氨酸位點(diǎn)與泛素結(jié)合,稱之為泛素化位點(diǎn),如果其他因子與該位點(diǎn)的賴氨酸競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,可阻止該蛋白降解。泛素結(jié)構(gòu)高度保守,性狀穩(wěn)定,其多樣性的基礎(chǔ)是與靶蛋白結(jié)合后通過(guò)泛素自身的不同賴氨酸殘基(Lys-residues)或氨基端(amimo terminus),形成結(jié)構(gòu)與功能迥異的泛素聚合體。在一系列酶的作用下,靶蛋白與泛素鏈的復(fù)合體進(jìn)入蛋白酶體內(nèi)的催化中心,靶蛋白被降解,泛素單體再次游離,與下一個(gè)靶蛋白結(jié)合,循環(huán)往復(fù)。泛素的賴氨酸殘基有7個(gè),它們形成了不同的泛素鏈,目前研究較清楚的是Lys48在蛋白酶體途徑的泛素化降解中起到重要作用,Lys63在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)中扮演重要角色。但是,還有5個(gè)賴氨酸殘基參與形成的泛素鏈功能尚未明確,被稱作“反常的泛素賴氨酸殘基”,它們是Lys6,Lys11,Lys27,Lys29,Lys33,而且,研究者發(fā)現(xiàn)這些反常泛素鏈的形成與靶蛋白諸多細(xì)胞功能相關(guān),是近期研究的熱點(diǎn)。有研究表明,下調(diào)泛素連接酶Siah可穩(wěn)定ELL2蛋白在體內(nèi)的水平,從而保證ELL2構(gòu)建超級(jí)延伸復(fù)合體并參與RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程。但ELL2經(jīng)泛素化途徑降解的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。本課題首先以臨床患者前列腺的病理標(biāo)本為研究對(duì)象,應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)人體前列腺癌組織與正常前列腺組織中ELL2表達(dá)差異,觀察隨著前列腺癌的惡性程度增高,ELL2表達(dá)趨勢(shì)的改變;繼而以前列腺癌C4-2細(xì)胞為研究對(duì)象,分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ELL2-si RNA下調(diào)ELL2基因表達(dá)與Flag-ELL2質(zhì)粒上調(diào)其表達(dá),利用MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞技術(shù)、Transwell小室技術(shù)等觀察對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖能力、凋亡率、侵襲力與遷移的影響;利用Western-Blot觀察增殖相關(guān)蛋白PCNA、凋亡基因caspase-3與PARP、侵襲性與遷移能力相關(guān)因子MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、N-cadherin、E-cadherin和ICAM-1蛋白表達(dá)變化的表達(dá)變化,探討ELL2可能在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制。關(guān)于ELL2泛素化相關(guān)研究:以前列腺癌C4-2細(xì)胞為研究對(duì)象,通過(guò)降解時(shí)間對(duì)比與免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)ELL2是通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解的蛋白。應(yīng)用質(zhì)粒重建與點(diǎn)突變技術(shù),鑒定ELL2泛素化位點(diǎn)。以293細(xì)胞為研究對(duì)象,把EAF1、EAF2分別與ELL2共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后通過(guò)降解時(shí)間對(duì)比與泛素化免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)鑒定EAF1與EAF2是否影響ELL2降解。最后,將ELL2與野生型泛素或不同的泛素賴氨酸殘基突變體共同轉(zhuǎn)染,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)鑒定參與ELL2泛素化的泛素賴氨酸殘基。本研究探索ELL2在前列腺癌中的作用,為調(diào)控ELL2在細(xì)胞內(nèi)的蛋白濃度,進(jìn)一步研發(fā)治療前列腺癌的靶點(diǎn)與藥物奠定基礎(chǔ)。方法1.ELL2在前列腺癌中的表達(dá)及其對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響1.1 ELL2在前列腺癌中的表達(dá)分別收集臨床前列腺癌組織29例及正常組織22例,免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)ELL2在這兩種不同組織中的表達(dá)情況。1.2雄激素作用下對(duì)前列腺癌細(xì)胞ELL2表達(dá)的影響用人工合成雄激素R1881刺激前列腺癌細(xì)胞株LNCa P和C4-2,Western blot和Real-time PCR檢測(cè)不同濃度及不同作用時(shí)間R1881對(duì)ELL2的影響。1.3 ELL2對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響分別用ELL2-si RNA和Flag-ELL2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌C4-2細(xì)胞,應(yīng)用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖率的變化;應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化;Western blot方法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原PCNA及凋亡蛋白Caspase3、PARP的變化;應(yīng)用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲、遷移能力的改變;Western blot方法檢測(cè)MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、ICAM-1、N-cadherin和E-cadherin的表達(dá)變化。2.ELL2泛素化降解關(guān)鍵片段、位點(diǎn)的研究;EAF1/EAF2對(duì)ELL2降解的影響;參與ELL2降解的泛素賴氨酸殘基的研究2.1 ELL2蛋白穩(wěn)定性的檢測(cè)用人工雄激素R1881刺激前列腺癌C4-2細(xì)胞表達(dá)ELL2蛋白后,應(yīng)用CHX抑制蛋白合成,Western blot檢測(cè)每小時(shí)ELL2蛋白水平,連續(xù)5小時(shí);分別用C4-2細(xì)胞及轉(zhuǎn)染ELL2的293細(xì)胞,檢測(cè)蛋白合成抑制劑CHX及蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)內(nèi)源性及外源性ELL2降解的影響。2.2 ELL2泛素化途徑降解及降解片段、位點(diǎn)的檢測(cè)Flag-ELL2與HA-Ub質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,MG132抑制蛋白酶體功能,應(yīng)用抗Flag的瓊脂糖珠做免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),Western blot檢測(cè)泛素表達(dá)情況;之后,將不同ELL2片段的Flag載體重組質(zhì)粒(片段1:aa1-aa292,片段2:aa293-aa531,片段3:aa532-aa640)轉(zhuǎn)染C4-2細(xì)胞,應(yīng)用CHX抑制蛋白合成后,Western blot檢測(cè)各片段4h、8h、12h、24h與1h、2h、3h、4h時(shí)間點(diǎn)Flag表達(dá)水平,對(duì)片段3加測(cè)15min、30min、45min、60min、75min時(shí)間點(diǎn)Flag表達(dá)水平;最后,將ELL2片段3(aa532-640)所包括的9個(gè)賴氨酸,均制備Flag載體K/R點(diǎn)突變質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染C4-2細(xì)胞,應(yīng)用CHX抑制蛋白合成,Western blot檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)0、6h、12h、24h的ELL2蛋白水平的變化。2.3 ELL結(jié)合因子EAF1/EAF2對(duì)ELL2降解影響的研究Flag-ELL2分別與Myc-Vector、Myc-EAF1與Myc-EAF2共同轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,應(yīng)用CHX抑制蛋白合成,Western blot檢測(cè)0h、6h、12h、24h ELL2蛋白水平;之后,將Flag-ELL2與HA-Ub共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞后,再分別轉(zhuǎn)染Myc-Vector、Myc-EAF1與Myc-EAF2,應(yīng)用MG132抑制蛋白酶體,抗FLAG瓊脂糖珠行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),利用Western blot方法檢測(cè)泛素與ELL2水平。2.4 ELL2泛素化降解的泛素賴氨酸位點(diǎn)的研究將野生型泛素質(zhì)粒和不同的泛素賴氨酸殘基突變體(K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)與Flag-ELL2共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞,應(yīng)用MG132抑制蛋白酶體,抗FLAG瓊脂糖珠行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),Western blot檢測(cè)泛素與ELL2水平。結(jié)果1.ELL2在前列腺癌中的表達(dá)及其對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響1.1 ELL2在前列腺癌中的表達(dá)降低免疫組化結(jié)果顯示,與正常前列腺組織相比,前列腺癌組織中ELL2表達(dá)明顯降低(P0.05),且隨著Gleason評(píng)分的增高,ELL2表達(dá)呈逐漸降低的趨勢(shì)(P0.01)。1.2 ELL2表現(xiàn)為雄激素依賴性Western blot和Real-time PCR結(jié)果顯示,R1881刺激后,LNCa P和C4-2細(xì)胞中ELL2蛋白(P0.05)及m RNA(P0.05)水平均升高,且在一定范圍內(nèi)表現(xiàn)為劑量、時(shí)間依賴性。1.3 ELL2對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響MTT結(jié)果顯示,前列腺癌C4-2細(xì)胞在轉(zhuǎn)染ELL2-si RNA后,細(xì)胞增殖率上升(P0.001)PCNA在蛋白水平上升(P0.05),而在轉(zhuǎn)染Flag-ELL2后,增殖率下降(P0.001),PCNA在蛋白水平下降(P0.05);流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染ELL2-si RNA組凋亡率下降(P0.05),而轉(zhuǎn)染Flag-ELL2組凋亡率升高(P0.01),Western blot結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染ELL2-si RNA組Caspase3、PARP蛋白水平下降(P0.05;P0.01),而轉(zhuǎn)染Flag-ELL2組Caspase3、PARP蛋白水平升高(P0.001;P0.001);Transwell結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染ELL2-si RNA組細(xì)胞侵襲、遷移能力均增加(P0.01,0.05;P0.01,P0.05),MMP2、MMP3、MMP9蛋白水平均升高(P0.01;P0.01;P0.01),N-cadherin、ICAM-1蛋白水平均升高(P0.05;P0.05),E-cadherin蛋白水平降低(P0.05),而轉(zhuǎn)染Flag-ELL2組細(xì)胞侵襲、遷移能力則下降(P0.01;P0.01),MMP2、MMP3、MMP9蛋白水平均下降(P0.05;P0.01;P0.01),N-cadherin、ICAM-1蛋白水平均下降(P0.01;P0.05),E-cadherin蛋白水平升高(P0.001)。2.ELL2泛素化降解關(guān)鍵片段、位點(diǎn)的研究;EAF1/EAF2對(duì)ELL2降解的影響;參與ELL2降解的泛素賴氨酸殘基的研究2.1 ELL2是不穩(wěn)定蛋白Western blot結(jié)果顯示,應(yīng)用CHX抑制蛋白合成后,ELL2蛋白水平逐漸下降,到5小時(shí)降至起點(diǎn)的20%以下;Western blot結(jié)果顯示,無(wú)論是內(nèi)源性還是外源性合成的ELL2蛋白,應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132后,ELL2蛋白水平均明顯高于對(duì)照組(P0.05;P0.05)。2.2 ELL2經(jīng)泛素化途徑降解;片段3(aa532-aa640)對(duì)于維持其蛋白穩(wěn)定性較重要;K571、K584、K599三個(gè)賴氨酸位點(diǎn)的突變有助于其維持蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性Flag-ELL2與泛素共同轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,應(yīng)用抗Flag的瓊脂糖珠做免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),Western blot結(jié)果顯示,應(yīng)用MG132抑制蛋白酶體后,在ELL2蛋白上方區(qū)域可見(jiàn)到明顯的泛素條帶,而對(duì)照組無(wú)泛素條帶;不同片段的ELL2載體轉(zhuǎn)染C4-2細(xì)胞后,Western blot結(jié)果顯示,片段3(aa532-aa640)降解速度明顯快于其他兩段,75min時(shí)已經(jīng)大部分降解;片段2(aa293-aa531)最穩(wěn)定,12h時(shí)降解尚不明顯;片段1(aa1-aa292)降解速度居中;不同位點(diǎn)的ELL2突變體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后,Western blot結(jié)果顯示,突變體K/R571、K/R584、K/R599的降解速度明顯較野生型ELL2慢,其他突變體與野生型ELL2相似。2.3 ELL結(jié)合因子EAF1/EAF2有助于維持ELL2蛋白的穩(wěn)定性與轉(zhuǎn)染Myc空載體相比較,轉(zhuǎn)染Myc-EAF1與Myc-EAF2均導(dǎo)致ELL2降解減慢。相比之下,轉(zhuǎn)染Myc-EAF2對(duì)ELL2降解的影響更明顯;并且,分別將Myc-EAF1、Myc-EAF2、HA-Ub與Flag-ELL2共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后,應(yīng)用抗Flag的瓊脂糖珠做免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),Western blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Myc-EAF1與Myc-EAF2的兩組較轉(zhuǎn)染Myc-Vector組泛素條帶明顯減弱,且ELL2對(duì)應(yīng)條帶明顯增強(qiáng)。2.4有5個(gè)泛素賴氨酸位點(diǎn)參與ELL2的泛素化降解野生型泛素質(zhì)粒和7個(gè)不同的泛素賴氨酸殘基突變體分別與Flag-ELL2共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后,應(yīng)用抗Flag的瓊脂糖珠做免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),Western blot結(jié)果顯示,應(yīng)用MG132抑制蛋白酶體后,K6、K11、K33、K48、K63均可見(jiàn)泛素條帶,其中K63、K6、K48較強(qiáng)。結(jié)論1.ELL2在人體前列腺癌組織中表達(dá)降低,且與腫瘤惡性度相關(guān)。2.ELL2是雄激素反應(yīng)蛋白,其表達(dá)的異�？赡芘c去勢(shì)抵抗性前列腺癌的進(jìn)展相關(guān)。3.ELL2蛋白上調(diào)在一定程度上可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖,增加其凋亡率,并抑制其侵襲、遷移能力,ELL2參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。4.ELL2蛋白在體內(nèi)經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解,其與泛素結(jié)合位點(diǎn)主要在氨基酸片段aa532-aa640中,該片段在維持ELL2的穩(wěn)定性上最為重要,K571、K584、K599三個(gè)賴氨酸是ELL2的泛素化位點(diǎn);ELL的輔助因子EAF1、EAF2均可通過(guò)阻止ELL2泛素化而維持ELL2蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。這些對(duì)ELL2蛋白結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)有助于調(diào)控ELL2細(xì)胞內(nèi)水平,從而為治療相關(guān)疾病提供分子水平上的依據(jù)。5.除K63及K48賴氨酸殘基外,還存在多個(gè)泛素賴氨酸殘基參與ELL2泛素化過(guò)程,提示ELL2可能與多種細(xì)胞功能有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.25

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本文編號(hào)：1749552