本文選題：前列腺癌 + ELL2��； 參考：《鄭州大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景和目的前列腺癌是男性發(fā)病率第二的腫瘤,僅次于第一位的肺癌,其死亡率在男性惡性腫瘤中排第五位。近二十年來,中國前列腺癌的發(fā)病率明顯升高。雖然前列腺癌在診療上取得了很大進展,但是,臨床工作中關(guān)于前列腺癌的惡性程度與預(yù)后判斷缺乏有效的檢測指標(biāo),而且,多數(shù)患者在歷經(jīng)一段有效的雄激素阻斷治療階段后,最終演變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔?目前的治療方法效果有限,如何控制雄激素非依賴前列腺癌進展,是泌尿系腫瘤領(lǐng)域眾所周知的難題。ELL2(eleven-nineteen lysine-rich leukemia 2)是ELL家族中重要的一員,作為SEC(super elongation complex)超級延伸復(fù)合體的主要成分,它與結(jié)合因子EAF1(ELL-associated factor 1)、EAF2(ELL-associated factor 2)等共同形成超級延伸復(fù)合體,作用于RNA聚合酶II,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄延伸速度。真核細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)異常是人類諸多疾病的原因,該領(lǐng)域是近年來的研究熱點。ELL2作為ELL蛋白家族中的一員,與ELL類似,它同樣可結(jié)合RNA聚合II,加快轉(zhuǎn)錄延伸速度,但ELL2表達或功能的異常是否同樣參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程,目前尚未見報道。腫瘤的發(fā)生是多種致病因子共同作用的結(jié)果,其中重要的一點是細胞脫離正常生長周期的調(diào)控,表現(xiàn)為過度增殖傾向,而且,腫瘤細胞逃逸正常免疫系統(tǒng)的監(jiān)視,其程序性死亡(凋亡)的調(diào)控出現(xiàn)異常,呈現(xiàn)出永生化傾向。細胞凋亡率降低是腫瘤形成和發(fā)展的重要因素之一,調(diào)控細胞凋亡信號通路的主要有以下兩條:細胞外死亡誘導(dǎo)信號如Fas配體和Fas受體信號通路以及細胞內(nèi)固有的凋亡通路(即程序性細胞死亡通路)。兩者最終都通過激活胞內(nèi)休眠的蛋白酶起作用,如caspase蛋白家族。前期的研究發(fā)現(xiàn),在前列腺增生組織中,ELL2表達水平上調(diào),但是,ELL2是否對前列腺癌細胞的增殖與凋亡有調(diào)控作用,尚不十分清楚。造成前列腺癌的預(yù)后不良的另外一個原因是其轉(zhuǎn)移和進展。在腫瘤細胞遷移和侵襲的過程中,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)起著主要作用,MMPs可以降解細胞外基質(zhì)(ECM),提高腫瘤細胞的侵襲力,尤其是MMP1、MMP2、MMP3和MMP9等。此外,細胞黏附分子,如細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、上皮細胞鈣粘蛋白(E-cadherin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)等在腫瘤細胞遷移中也起一定作用。ELL2對于前列腺癌細胞侵襲與遷移能力的影響也有待于實驗證實。真核細胞內(nèi)的大多數(shù)蛋白質(zhì)通過泛素-蛋白酶體途徑降解,泛素化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的過程,對蛋白活化、濃度調(diào)節(jié)、降解都發(fā)揮重要作用,如果需要上調(diào)靶蛋白水平,阻止其泛素化降解是一種重要方法。每個蛋白都在特定的賴氨酸位點與泛素結(jié)合,稱之為泛素化位點,如果其他因子與該位點的賴氨酸競爭性結(jié)合,可阻止該蛋白降解。泛素結(jié)構(gòu)高度保守,性狀穩(wěn)定,其多樣性的基礎(chǔ)是與靶蛋白結(jié)合后通過泛素自身的不同賴氨酸殘基(Lys-residues)或氨基端(amimo terminus),形成結(jié)構(gòu)與功能迥異的泛素聚合體。在一系列酶的作用下,靶蛋白與泛素鏈的復(fù)合體進入蛋白酶體內(nèi)的催化中心,靶蛋白被降解,泛素單體再次游離,與下一個靶蛋白結(jié)合,循環(huán)往復(fù)。泛素的賴氨酸殘基有7個,它們形成了不同的泛素鏈,目前研究較清楚的是Lys48在蛋白酶體途徑的泛素化降解中起到重要作用,Lys63在細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)中扮演重要角色。但是,還有5個賴氨酸殘基參與形成的泛素鏈功能尚未明確,被稱作“反常的泛素賴氨酸殘基”,它們是Lys6,Lys11,Lys27,Lys29,Lys33,而且,研究者發(fā)現(xiàn)這些反常泛素鏈的形成與靶蛋白諸多細胞功能相關(guān),是近期研究的熱點。有研究表明,下調(diào)泛素連接酶Siah可穩(wěn)定ELL2蛋白在體內(nèi)的水平,從而保證ELL2構(gòu)建超級延伸復(fù)合體并參與RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。但ELL2經(jīng)泛素化途徑降解的具體分子機制仍需進一步探討。本課題首先以臨床患者前列腺的病理標(biāo)本為研究對象,應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測人體前列腺癌組織與正常前列腺組織中ELL2表達差異,觀察隨著前列腺癌的惡性程度增高,ELL2表達趨勢的改變;繼而以前列腺癌C4-2細胞為研究對象,分別瞬時轉(zhuǎn)染ELL2-si RNA下調(diào)ELL2基因表達與Flag-ELL2質(zhì)粒上調(diào)其表達,利用MTT實驗、流式細胞技術(shù)、Transwell小室技術(shù)等觀察對前列腺癌細胞增殖能力、凋亡率、侵襲力與遷移的影響;利用Western-Blot觀察增殖相關(guān)蛋白PCNA、凋亡基因caspase-3與PARP、侵襲性與遷移能力相關(guān)因子MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、N-cadherin、E-cadherin和ICAM-1蛋白表達變化的表達變化,探討ELL2可能在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制。關(guān)于ELL2泛素化相關(guān)研究:以前列腺癌C4-2細胞為研究對象,通過降解時間對比與免疫共沉淀實驗證實ELL2是通過泛素-蛋白酶體途徑降解的蛋白。應(yīng)用質(zhì)粒重建與點突變技術(shù),鑒定ELL2泛素化位點。以293細胞為研究對象,把EAF1、EAF2分別與ELL2共同瞬時轉(zhuǎn)染后通過降解時間對比與泛素化免疫共沉淀實驗鑒定EAF1與EAF2是否影響ELL2降解。最后,將ELL2與野生型泛素或不同的泛素賴氨酸殘基突變體共同轉(zhuǎn)染,免疫共沉淀實驗鑒定參與ELL2泛素化的泛素賴氨酸殘基。本研究探索ELL2在前列腺癌中的作用,為調(diào)控ELL2在細胞內(nèi)的蛋白濃度,進一步研發(fā)治療前列腺癌的靶點與藥物奠定基礎(chǔ)。方法1.ELL2在前列腺癌中的表達及其對前列腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響1.1 ELL2在前列腺癌中的表達分別收集臨床前列腺癌組織29例及正常組織22例,免疫組織化學(xué)方法檢測ELL2在這兩種不同組織中的表達情況。1.2雄激素作用下對前列腺癌細胞ELL2表達的影響用人工合成雄激素R1881刺激前列腺癌細胞株LNCa P和C4-2,Western blot和Real-time PCR檢測不同濃度及不同作用時間R1881對ELL2的影響。1.3 ELL2對前列腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響分別用ELL2-si RNA和Flag-ELL2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌C4-2細胞,應(yīng)用MTT方法檢測細胞增殖率的變化;應(yīng)用流式細胞技術(shù)檢測細胞凋亡率的變化;Western blot方法檢測增殖細胞核抗原PCNA及凋亡蛋白Caspase3、PARP的變化;應(yīng)用Transwell小室檢測細胞侵襲、遷移能力的改變;Western blot方法檢測MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、ICAM-1、N-cadherin和E-cadherin的表達變化。2.ELL2泛素化降解關(guān)鍵片段、位點的研究;EAF1/EAF2對ELL2降解的影響;參與ELL2降解的泛素賴氨酸殘基的研究2.1 ELL2蛋白穩(wěn)定性的檢測用人工雄激素R1881刺激前列腺癌C4-2細胞表達ELL2蛋白后,應(yīng)用CHX抑制蛋白合成,Western blot檢測每小時ELL2蛋白水平,連續(xù)5小時;分別用C4-2細胞及轉(zhuǎn)染ELL2的293細胞,檢測蛋白合成抑制劑CHX及蛋白酶體抑制劑MG132對內(nèi)源性及外源性ELL2降解的影響。2.2 ELL2泛素化途徑降解及降解片段、位點的檢測Flag-ELL2與HA-Ub質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞,MG132抑制蛋白酶體功能,應(yīng)用抗Flag的瓊脂糖珠做免疫共沉淀實驗,Western blot檢測泛素表達情況;之后,將不同ELL2片段的Flag載體重組質(zhì)粒(片段1:aa1-aa292,片段2:aa293-aa531,片段3:aa532-aa640)轉(zhuǎn)染C4-2細胞,應(yīng)用CHX抑制蛋白合成后,Western blot檢測各片段4h、8h、12h、24h與1h、2h、3h、4h時間點Flag表達水平,對片段3加測15min、30min、45min、60min、75min時間點Flag表達水平;最后,將ELL2片段3(aa532-640)所包括的9個賴氨酸,均制備Flag載體K/R點突變質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染C4-2細胞,應(yīng)用CHX抑制蛋白合成,Western blot檢測時間點0、6h、12h、24h的ELL2蛋白水平的變化。2.3 ELL結(jié)合因子EAF1/EAF2對ELL2降解影響的研究Flag-ELL2分別與Myc-Vector、Myc-EAF1與Myc-EAF2共同轉(zhuǎn)染293細胞,應(yīng)用CHX抑制蛋白合成,Western blot檢測0h、6h、12h、24h ELL2蛋白水平;之后,將Flag-ELL2與HA-Ub共轉(zhuǎn)染至293細胞后,再分別轉(zhuǎn)染Myc-Vector、Myc-EAF1與Myc-EAF2,應(yīng)用MG132抑制蛋白酶體,抗FLAG瓊脂糖珠行免疫共沉淀實驗,利用Western blot方法檢測泛素與ELL2水平。2.4 ELL2泛素化降解的泛素賴氨酸位點的研究將野生型泛素質(zhì)粒和不同的泛素賴氨酸殘基突變體(K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)與Flag-ELL2共轉(zhuǎn)染至293細胞,應(yīng)用MG132抑制蛋白酶體,抗FLAG瓊脂糖珠行免疫共沉淀實驗,Western blot檢測泛素與ELL2水平。結(jié)果1.ELL2在前列腺癌中的表達及其對前列腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響1.1 ELL2在前列腺癌中的表達降低免疫組化結(jié)果顯示,與正常前列腺組織相比,前列腺癌組織中ELL2表達明顯降低(P0.05),且隨著Gleason評分的增高,ELL2表達呈逐漸降低的趨勢(P0.01)。1.2 ELL2表現(xiàn)為雄激素依賴性Western blot和Real-time PCR結(jié)果顯示,R1881刺激后,LNCa P和C4-2細胞中ELL2蛋白(P0.05)及m RNA(P0.05)水平均升高,且在一定范圍內(nèi)表現(xiàn)為劑量、時間依賴性。1.3 ELL2對前列腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響MTT結(jié)果顯示,前列腺癌C4-2細胞在轉(zhuǎn)染ELL2-si RNA后,細胞增殖率上升(P0.001)PCNA在蛋白水平上升(P0.05),而在轉(zhuǎn)染Flag-ELL2后,增殖率下降(P0.001),PCNA在蛋白水平下降(P0.05);流式細胞儀結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染ELL2-si RNA組凋亡率下降(P0.05),而轉(zhuǎn)染Flag-ELL2組凋亡率升高(P0.01),Western blot結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染ELL2-si RNA組Caspase3、PARP蛋白水平下降(P0.05;P0.01),而轉(zhuǎn)染Flag-ELL2組Caspase3、PARP蛋白水平升高(P0.001;P0.001);Transwell結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染ELL2-si RNA組細胞侵襲、遷移能力均增加(P0.01,0.05;P0.01,P0.05),MMP2、MMP3、MMP9蛋白水平均升高(P0.01;P0.01;P0.01),N-cadherin、ICAM-1蛋白水平均升高(P0.05;P0.05),E-cadherin蛋白水平降低(P0.05),而轉(zhuǎn)染Flag-ELL2組細胞侵襲、遷移能力則下降(P0.01;P0.01),MMP2、MMP3、MMP9蛋白水平均下降(P0.05;P0.01;P0.01),N-cadherin、ICAM-1蛋白水平均下降(P0.01;P0.05),E-cadherin蛋白水平升高(P0.001)。2.ELL2泛素化降解關(guān)鍵片段、位點的研究;EAF1/EAF2對ELL2降解的影響;參與ELL2降解的泛素賴氨酸殘基的研究2.1 ELL2是不穩(wěn)定蛋白Western blot結(jié)果顯示,應(yīng)用CHX抑制蛋白合成后,ELL2蛋白水平逐漸下降,到5小時降至起點的20%以下;Western blot結(jié)果顯示,無論是內(nèi)源性還是外源性合成的ELL2蛋白,應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132后,ELL2蛋白水平均明顯高于對照組(P0.05;P0.05)。2.2 ELL2經(jīng)泛素化途徑降解;片段3(aa532-aa640)對于維持其蛋白穩(wěn)定性較重要;K571、K584、K599三個賴氨酸位點的突變有助于其維持蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性Flag-ELL2與泛素共同轉(zhuǎn)染293細胞,應(yīng)用抗Flag的瓊脂糖珠做免疫共沉淀實驗,Western blot結(jié)果顯示,應(yīng)用MG132抑制蛋白酶體后,在ELL2蛋白上方區(qū)域可見到明顯的泛素條帶,而對照組無泛素條帶;不同片段的ELL2載體轉(zhuǎn)染C4-2細胞后,Western blot結(jié)果顯示,片段3(aa532-aa640)降解速度明顯快于其他兩段,75min時已經(jīng)大部分降解;片段2(aa293-aa531)最穩(wěn)定,12h時降解尚不明顯;片段1(aa1-aa292)降解速度居中;不同位點的ELL2突變體轉(zhuǎn)染至細胞后,Western blot結(jié)果顯示,突變體K/R571、K/R584、K/R599的降解速度明顯較野生型ELL2慢,其他突變體與野生型ELL2相似。2.3 ELL結(jié)合因子EAF1/EAF2有助于維持ELL2蛋白的穩(wěn)定性與轉(zhuǎn)染Myc空載體相比較,轉(zhuǎn)染Myc-EAF1與Myc-EAF2均導(dǎo)致ELL2降解減慢。相比之下,轉(zhuǎn)染Myc-EAF2對ELL2降解的影響更明顯;并且,分別將Myc-EAF1、Myc-EAF2、HA-Ub與Flag-ELL2共轉(zhuǎn)染293細胞后,應(yīng)用抗Flag的瓊脂糖珠做免疫共沉淀實驗,Western blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Myc-EAF1與Myc-EAF2的兩組較轉(zhuǎn)染Myc-Vector組泛素條帶明顯減弱,且ELL2對應(yīng)條帶明顯增強。2.4有5個泛素賴氨酸位點參與ELL2的泛素化降解野生型泛素質(zhì)粒和7個不同的泛素賴氨酸殘基突變體分別與Flag-ELL2共轉(zhuǎn)染293細胞后,應(yīng)用抗Flag的瓊脂糖珠做免疫共沉淀實驗,Western blot結(jié)果顯示,應(yīng)用MG132抑制蛋白酶體后,K6、K11、K33、K48、K63均可見泛素條帶,其中K63、K6、K48較強。結(jié)論1.ELL2在人體前列腺癌組織中表達降低,且與腫瘤惡性度相關(guān)。2.ELL2是雄激素反應(yīng)蛋白,其表達的異�？赡芘c去勢抵抗性前列腺癌的進展相關(guān)。3.ELL2蛋白上調(diào)在一定程度上可抑制前列腺癌細胞的增殖,增加其凋亡率,并抑制其侵襲、遷移能力,ELL2參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。4.ELL2蛋白在體內(nèi)經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解,其與泛素結(jié)合位點主要在氨基酸片段aa532-aa640中,該片段在維持ELL2的穩(wěn)定性上最為重要,K571、K584、K599三個賴氨酸是ELL2的泛素化位點;ELL的輔助因子EAF1、EAF2均可通過阻止ELL2泛素化而維持ELL2蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。這些對ELL2蛋白結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)有助于調(diào)控ELL2細胞內(nèi)水平,從而為治療相關(guān)疾病提供分子水平上的依據(jù)。5.除K63及K48賴氨酸殘基外,還存在多個泛素賴氨酸殘基參與ELL2泛素化過程,提示ELL2可能與多種細胞功能有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25

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本文編號：1749552