本文選題：解脲脲原體 + 活性氧物質(zhì)�。� 參考：《南華大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：背景與目的:解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum,Uu)是能在體外培養(yǎng)的最小的原核細(xì)胞型微生物之一。Uu是人類泌尿生殖道一種常見(jiàn)的病原體,除了與尿道炎、前列腺炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和盆腔炎等疾病密切相關(guān)外,Uu感染還可導(dǎo)致精子尾部缺陷、活動(dòng)力下降及精子內(nèi)活性氧上升,從而可能導(dǎo)致男性不育。活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)是生物機(jī)體正常有氧代謝中不可避免的副產(chǎn)物,人巨噬細(xì)胞能夠利用ROS以殺傷入侵的病原菌。為了能夠在機(jī)體內(nèi)存活,病原菌在進(jìn)化過(guò)程中形成了多種機(jī)制來(lái)抵抗ROS引起的損傷。Uu在定植過(guò)程中不可避免會(huì)遭遇過(guò)氧化傷害,因此,抗氧化能力對(duì)于Uu的存活及其致病性至關(guān)重要。迄今為止,Uu的抗氧化作用機(jī)制仍不清楚。本文旨在通過(guò)研究Uu鐵蛋白(Ferritin)和蛋氨酸亞砜還原酶(Msr A)的抗氧化功能及其作用機(jī)制,為闡明Uu的抗氧化作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.按照200∶1的比例將Uu與THP-1細(xì)胞分別共孵育3h、6h、12h和24h,取細(xì)胞培養(yǎng)上清,加入DCFH-DA以測(cè)定ROS含量。2.利用生物信息學(xué)方法分析Uu的Ferritin和Msr A的編碼基因。3.分別用H2O2、異丙苯基過(guò)氧化氫(Cumene hydroperoxide,CHP)和叔丁基氫過(guò)氧化物(t-BHP)脅迫Uu 20min、40min和60min,熒光定量PCR測(cè)定脅迫條件下Ferritin和Msr A基因的表達(dá)情況。4.PCR擴(kuò)增Ferritin和Msr A基因片段,將其分別連接到表達(dá)載體p ET28a以獲得重組載體p ET28a-Ferritin和p ET28a-Msr A,將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21,用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),并經(jīng)Ni2+親和層析柱純化目的蛋白。5.利用固相親和層析法和內(nèi)源熒光法測(cè)定Ferritin蛋白和Fe2+的結(jié)合情況;用分光光度法測(cè)定Ferritin蛋白的促鐵氧化動(dòng)力學(xué)曲線;并用體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定Ferritin蛋白的抗氧化能力;用凝膠阻滯法檢測(cè)Ferritin蛋白與DNA的結(jié)合能力及其保護(hù)DNA的功能。6.將Ferritin基因連接到表達(dá)載體p Trc99a構(gòu)建p Trc99a-Ferritin重組載體,將其轉(zhuǎn)化入氧化敏感型大腸桿菌突變株(Δdps,JW0797-1),分別測(cè)定重組菌和對(duì)照菌在氧化脅迫下的存活率。7.分光光度法測(cè)定重組Uu Msr A蛋白將Met-O還原為Met的功能。8.將Msr A基因連接到p Trc99a以獲得p Trc99a-Msr A重組載體,將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌突變體(ΔMsr A,JW4178-3),測(cè)定該重組菌和對(duì)照菌在不同氧化脅迫下的存活率。結(jié)果:1.Uu感染能夠誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生ROS。2.經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析,發(fā)現(xiàn)Uu基因組中含有一個(gè)Ferritin和Msr A基因。3.Ferritin基因在H2O2脅迫20、40或60min后,Ferritin基因的表達(dá)量分別上調(diào)了3.5倍、4.4倍和5.1倍;在經(jīng)過(guò)CHP脅迫20、40或60min后,Ferritin基因的表達(dá)量都上調(diào)了4倍;在經(jīng)t-BHP脅迫20、40或60min后,基因表達(dá)量則分別上調(diào)了2.4倍、3.2倍和3.1倍。Uu Msr A基因在H2O2脅迫20、40或者60min時(shí),Msr A基因的表達(dá)量分別上調(diào)了4.5倍、6倍和6倍;在經(jīng)CHP脅迫20、40或者60min時(shí),其表達(dá)量都上調(diào)了11倍,而在經(jīng)t-BHP脅迫時(shí)則分別上調(diào)了3倍、3.5倍和4倍。4.成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體p ET28a-Ferritin和p ET28a-Msr A,用IPTG分別誘導(dǎo)含有重組載體的重組菌表達(dá)了分子量約為22k Da的重組Ferritin蛋白和分子量約為21k Da的重組Msr A蛋白,經(jīng)親和層析后獲得了純化的重組Ferritin蛋白和Msr A蛋白。5.Ferritin蛋白能夠結(jié)合Fe2+離子,Fe2+離子能使Ferritin蛋白的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度降低;重組Uu Ferritin蛋白具有亞鐵氧化酶功能,可將Fe2+氧化成Fe3+;Ferritin蛋白具有抗氧化功能,其IC50值明顯低于BSA蛋白的IC50值(p0.05)。H2O2和Fe2+可以誘導(dǎo)Ferritin蛋白與DNA結(jié)合,并且Ferritin蛋白能夠阻止DNA受到氧化損傷。6.與對(duì)照組(轉(zhuǎn)化p Trc99a空載體)相比,轉(zhuǎn)化p Trc99a-Ferritin突變株的大腸桿菌對(duì)氧化應(yīng)激表現(xiàn)為高耐受性(p0.05)。7.Msr A蛋白具有將Met O還原為Met的能力。8.轉(zhuǎn)化了Msr A基因的ΔMsr A大腸桿菌突變體獲得了氧化應(yīng)激耐受力。結(jié)論:1.氧化應(yīng)激能夠上調(diào)Uu Ferritin基因的表達(dá);Uu Ferritin蛋白具有Fe2+結(jié)合特性及亞鐵氧化活性;Fe2+和H2O2能夠誘導(dǎo)Ferritin與DNA發(fā)生結(jié)合,并且能夠保護(hù)DNA免受氧化損傷;Uu Ferritin蛋白在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)都具有抗氧化能力,Ferritin蛋白在Uu的抗氧化脅迫中發(fā)揮重要作用。2.氧化應(yīng)激能夠上調(diào)Uu Msr A基因的表達(dá);Msr A蛋白能夠?qū)⒀趸蚆et(L-Met O)還原為Met;Msr A蛋白的表達(dá)能夠提高氧化敏感型E.coli(ΔMsr A)的抗氧化脅迫能力;當(dāng)Uu處于氧化脅迫時(shí),Msr A蛋白能夠修復(fù)氧化損傷的蛋白質(zhì),因而發(fā)揮抵抗氧化應(yīng)激的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R691.3

【參考文獻(xiàn)】

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4 黃s，

本文編號(hào)：1735976