本文選題：Hsp70 + Hsp90��； 參考：《北京中醫(yī)藥大學》2015年碩士論文

【摘要】：研究目的：WHO報道,發(fā)達國家育齡夫婦中不孕不育的發(fā)生率為15%,其中男性原因占到50%。男性不育可由全身內(nèi)分泌疾病引起,也可因生精障礙導致無精、少精或死精,還可因在生殖管道中運輸障礙而致,其中生精障礙是主要原因。本課題試圖較深入地研究睪丸熱激誘導生精障礙的分子機制,熱休克蛋白在生精細胞凋亡過程中的保護機制,以及五子衍宗丸對生精障礙的作用及機制,闡明其分子靶點,拓寬中藥方劑在生精障礙所致男性不育的臨床應(yīng)用范圍。研究方法：實驗一：66只雄性大鼠隨機分組為正常組(6只)、10 min熱激組(30只)、20 min熱激組(30只),43℃(正常組22℃)水浴熱激。10min與20 min熱激組分別在熱激后0.5h、2h、6h、24h、48h取材進行指標檢測,HE觀察形態(tài)變化,Real time PCR檢測Hsp70、Hsp90、Hsp105、Bax、Bcl-2 mRNA的表達。實驗二：36只雄性大鼠隨機分組為正常組、熱激組,43℃(正常組22℃)水浴熱激20min。熱激組分別在熱激后0.5 h、2 h、6 h、24 h、48 h取材進行指標檢測,HE觀察形態(tài)變化,TUNEL檢測生精細胞凋亡信號的變化,Real time PCR檢測Hsp70、 Hsp90、Hsp105、Bax、Bcl-2 mRNA的表達,Western blot檢測活化caspase-3的表達。實驗三：102只雄性大鼠隨機分組為正常組(24只)、模型組(24只),低、中、高劑量組(各18只),43℃(正常組22℃)水浴熱激20 min。分別在0天(造模當天)、給藥后5天、10天、15天取血取材進行指標檢測,放射免疫法檢測血清FSH、LH、T的變化,HE觀察形態(tài)變化,Real time PCR檢測Hsp70、Hsp90、Hsp105、Bax、 Bcl-2 mRNA的表達。研究結(jié)果：實驗一：43℃、10 min睪丸熱激后,各組的生精上皮沒有發(fā)生明顯變化。而43℃、20 min熱激模型6h后,生精上皮已發(fā)生明顯變化,上皮排列紊亂,生精細胞已經(jīng)開始脫落,甚至形成了多核巨細胞；熱激后24 h,生精上皮變薄,生精細胞彼此分離并脫落造成生精上皮有很多不規(guī)則的空隙,管腔內(nèi)缺失精母細胞和圓形精子細胞；熱激后48 h,曲細精管形態(tài)進一步紊亂,并形成了多個多核巨大細胞和變性空泡細胞。43℃熱激后0.5 h時,20 min熱激模型Hsp70 mRNA的表達量大約是10min熱激模型組的3倍,而2h時達到了3.5倍,熱激后6h時,10 min熱激模型組Hsp70 mRNA水平已恢復(fù)到正常水平,而20 min熱激模型組依然保持高表達量。同樣,Hsp90、Hsp105、Bax、Bcl-2 mRNA, Bcl-2/Bax在20 min熱激模型組的表達變化幅度比10 min熱激模型組大。實驗二：43℃、20 min睪丸熱激后生精細胞逐漸脫落甚至缺失,TUNEL檢測凋亡信號發(fā)現(xiàn),在熱激后0.5 h、2 h時曲細精管沒有明顯變化,而6 h后曲細精管中陽性細胞數(shù)明顯增多,24h時表現(xiàn)最為嚴重,48 h后陽性細胞數(shù)反而較少,這與HE檢測的形態(tài),生精細胞嚴重脫落缺失變化一致。熱激后Hsp70 mRNA的表達迅速上調(diào),0.5 h組、2 h組與正常組之間有統(tǒng)計學差異(P0.05)；熱激后Hsp90 mRNA的表達下調(diào),各熱激組與正常組之間均有統(tǒng)計學差異(P0.05)；而Hsp105 mRNA的表達是逐漸上調(diào),在熱激后6 h時達到最高,且與正常組之間有統(tǒng)計學差異(P0.05)；各熱激組Bax的表達與正常組相比均無統(tǒng)計學差異(P0.05), Bcl-2 mRNA的表達在熱激0.5 h、2 h、6 h組與正常組之間比較均有統(tǒng)計學差異(P0.05).更有趣的是,熱激后Bcl-2/Bax逐漸升高,且熱激0.5 h、2 h、6 h組與正常組之間相比均有統(tǒng)計學差異(P0.05)�；罨痗aspase-3在2 h時表達最少,與正常組之間有統(tǒng)計學差異(P0.05)。實驗三：FSH、LH、T的各亞組之間均沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。正常組的睪丸組織形態(tài),生精上皮完整,各級生精細胞及精子細胞排列有序；造模當天模型組的各級生精細胞松散,胞間的連接組織有些消失。熱激后5天時,各熱激組均出現(xiàn)了變性空泡細胞和多核巨大細胞,間質(zhì)細胞稍有增厚；五子衍宗丸各給藥組與模型組在形態(tài)上沒有明顯差異。熱激后10天時,各熱激組精母細胞嚴重缺失,生精上皮薄且紊亂,各級生精細胞層次消失,甚至有明顯空腔現(xiàn)象,間質(zhì)細胞明顯增厚；五子衍宗丸各給藥組與模型組在形態(tài)上沒有明顯差異。熱激后15天時,曲細精管中生精上皮嚴重破壞,管腔中生精細胞枯竭；五子衍宗丸各給藥組與模型組在形態(tài)上沒有明顯差異。Hsp70 mRNA的表達在睪丸熱激后各組之間均沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。睪丸熱激后5天時,模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組Hsp90 mRNA的表達量均比正常組降低,且與正常組之間均有統(tǒng)計學差異(P0.05)；熱激后5天、10天模型組的Hsp90 mRNA表達與熱激當天模型組之間均有統(tǒng)計學差異(P0.05)；其他兩組之間均沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。Hsp105 mRNA的表達在睪丸熱激后5天的模型組、低劑量組、高劑量組與正常組之間有統(tǒng)計學差異(P0.05)；其他兩組之間均沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。Bax mRNA的表達在睪丸熱激后5天的中劑量組與正常組之間有統(tǒng)計學差異(P0.05),其表達在熱激后10天、15天模型組與熱激當天模型組之間均有統(tǒng)計學差異(P0.05)；其他兩組之間均沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。Bc1-2 mRNA的表達在睪丸熱激后10天的模型組與正常組之間有統(tǒng)計學差異(P0.05),其表達在熱激后10天、15天模型組與熱激當天模型組之間均有統(tǒng)計學差異(P0.05)；其他兩組之間均沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。Bc1-2/Bax在睪丸熱激后10天、15天模型組與熱激當天模型組之間均有統(tǒng)計學差異(P0.05)；其他兩組之間均沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。研究結(jié)論：實驗一：大鼠睪丸43℃、20 min水浴熱激能夠成功建立一種生精障礙模型。實驗二：大鼠睪丸43℃、20min水浴熱激后,Hsp70早期的高表達,Hsp90表達下調(diào),Hsp105表達逐漸增高,有可能通過上調(diào)Bc1-2/Bax、下調(diào)活化caspase-3避免生精細胞的凋亡從而起到保護作用。實驗三：大鼠睪丸43℃、20min水浴熱激后,灌胃給予五子衍宗丸5天、10天、15天,均不能逆轉(zhuǎn)生精細胞Hsp70、Hsp90、Hsp105的表達,也不能抑制生精細胞的凋亡。
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【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R698

【參考文獻】

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