本文選題：狼瘡性腎炎　切入點：系膜細胞　出處：《河北醫(yī)科大學》2015年博士論文

【摘要】：目的:狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡最常見且嚴重的并發(fā)癥,也是繼發(fā)性腎病導致終末期腎衰竭的常見病因之一。狼瘡性腎炎常見的病理變化是系膜細胞增殖和系膜基質增多,并伴有炎性細胞浸潤。系膜細胞是腎小球內最活躍的固有細胞,多種細胞因子可以刺激系膜細胞增生,而持續(xù)的系膜細胞增生,必然引起細胞外基質合成增多,成分異常和腎小球硬化。Periostin是一種分泌型細胞間基質蛋白,表達在膠原豐富的組織,綁定到膠原-I、膠原-V、纖連蛋白、腱生蛋白-C、肝素等,參與細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的結構,是αvβ1、β3、β4和β5整合素的配體。Periostin具有重要的生理功能,可以介導細胞和基質的粘附,調節(jié)一定的細胞行為,包括細胞內信號轉導,增殖和分化,調節(jié)細胞粘附和基質沉積等。Periostin能夠誘導心肌細胞進入有絲分裂,促進腫瘤細胞增殖、存活、遷移和侵襲,并與心肌纖維化和支氣管哮喘粘膜下纖維化,肝纖維化有關;參與多種炎性疾病如鼻竇炎,過敏性皮炎,哮喘,肝炎,動脈粥樣硬化等;與多種自身免疫性疾病如類風濕關節(jié)炎,系統(tǒng)性硬化病,強直性脊柱炎等的發(fā)病及進展相關。多種細胞因子和生長因子都可以誘導periostin的表達,如IL-1β,IL-4,IL-13,IL-17,TGF-β1,PDGF-BB,Ang-II等。Periostin在正常腎臟幾乎不表達,在糖尿病腎病,單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral occlusion,UUO)鼠模型的腎臟遠端小管表達,在狼瘡性腎炎,Ig A腎病的腎小球有表達,但其在狼瘡性腎炎中的具體作用及在發(fā)病機制和病程進展中的作用未見進一步的研究。本研究擬以狼瘡性腎炎模型MRL/faslpr小鼠和小鼠系膜細胞為研究對象,探討periostin在狼瘡性腎炎腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質增生中的作用及其可能的作用機制,并采用電穿孔技術對小鼠進行活體轉染,檢測敲低periostin表達對小鼠腎小球病變和腎功能的改善情況,為狼瘡性腎炎的病因研究和靶向治療提供依據。方法1狼瘡性腎炎模型小鼠腎組織periostin、PCNA、Fn、TGF-β1的表達水平檢測24周齡MRL/MPJ小鼠6只作為對照組(Control組),MRL/faslpr小鼠6只為狼瘡性腎炎組(LN組)。留取24h尿液,內眥動脈取血后處死小鼠,取腎臟皮質,部分腎組織置于4%多聚甲醛固定液中固定,用于光鏡、免疫組織化學、免疫熒光檢測;部分腎皮質組織置于液氮保存,用于腎小球目的蛋白檢測。常規(guī)病理染色技術觀察腎小球形態(tài)結構;免疫熒光和免疫組化技術及Western blot檢測腎組織periostin、PCNA、Fn、TGF-β1蛋白的表達;半自動生化分析儀檢測血Scr、BUN和24h尿蛋白生化指標。ELISA方法檢測血清PDGF-BB水平。2體外培養(yǎng)小鼠系膜細胞增殖和細胞外基質增生水平的檢測及與periostin表達水平的關系小鼠系膜細胞在37℃、5%CO2條件下,給予含10%胎牛血清的DMEM/F12(3:1)培養(yǎng)基培養(yǎng)。脂質體介導向細胞內轉染sh-periostin沉默質粒和periostin表達質粒,Western blot檢測小鼠系膜細胞periostin蛋白表達水平。⑴檢測PDGF對periostin表達及系膜細胞的增殖和細胞外基質的影響:細胞以6孔板培養(yǎng)24h后換含10ng/ml PDGF刺激物的培養(yǎng)基,分別于刺激2h、4h、6h、12h時收集細胞提取細胞總蛋白。western blot檢測periostin、PCNA、Fn、TGF-β1蛋白的表達水平。⑵檢測轉染periostin表達質粒對系膜細胞的增殖和細胞外基質的影響:細胞隨機分為對照組(Control組)、空質粒轉染組、periostin表達質粒組,24h后收集細胞,Western blot和免疫細胞化學檢測細胞蛋白periostin、PCNA、Fn、TGF-β1表達水平。⑶轉染periostin沉默質粒檢測PDGF引起的系膜細胞增殖和細胞外基質生成是否通過periostin起作用:細胞隨機分為對照組,PDGF組,PDGF+空質粒組和PDGF+sh-periostin沉默質粒組。細胞以10 ng/ml PDGF孵育6h,收集4組細胞提取細胞總蛋白。Western blot檢測細胞蛋白periostin、PCNA、Fn、TGF-β1表達水平。3敲低MRL/faslpr小鼠腎皮質periostin的表達,檢測小鼠腎臟細胞增殖和細胞外基質增生水平及蛋白尿水平的變化24周齡MRL/MPJ小鼠6只設為對照組(Control組),18只等周齡等體重MRL/faslpr小鼠隨機分為狼瘡性腎炎組(LN組),對照質粒干預組方法:(LN+sh-NC組)和sh-periostin質粒干預組(LN+sh-periostin組)。電穿孔技術向治療組小鼠腎臟皮質轉染干擾質粒。3周后留取24h尿液和取血清后處死小鼠,取腎臟皮質,部分腎組織置于4%多聚甲醛固定液中固定,用于光鏡、免疫組織化學和免疫熒光檢測;部分置于液氮保存,用于腎小球目的蛋白水平檢測。常規(guī)病理染色技術觀察腎小球形態(tài)結構;免疫熒光、免疫組化技術和Western blot檢測腎皮質periostin,PCNA、Fn、TGF-β1蛋白的表達;半自動生化分析儀檢測血Scr、BUN和24h尿蛋白生化指標。4 PDGF誘導periostin在體外培養(yǎng)小鼠系膜細胞的表達及與PI3K/Akt信號通路的關系PDGF相關信號通路檢測:細胞以10 ng/ml PDGF孵育0h、30min、2h、4h、6h和12h,收集不同時間點細胞,Western blot檢測信號通路相關因子p-Akt-ser473,Akt的表達。PI3K/Akt信號通路在PDGF誘導periostin表達及促進系膜細胞增殖和細胞外基質增生中的作用:細胞分為Control組,PDGF組,PDGF+DMSO組,PDGF+LY294002組,細胞以20 umol/L LY294002或DMSO孵育1h,10ng/ml PDGF孵育6h收集細胞,Western blot檢測periostin、p-Akt-ser473、Akt、PCNA、Fn、TGF-β1表達水平。結果1 Periostin、PCNA和Fn、TGF-β1在LN組小鼠腎組織的表達水平升高。⑴與Control組相比,LN組小鼠血BUN水平明顯增高,血Scr水平無明顯改變,24小時蛋白尿水平明顯增高。⑵光鏡下觀察,與Control組相比,LN組小鼠腎小球體積增大,細胞數增多。PAS染色顯示對照組沒有明顯的細胞外基質積聚,而在狼瘡性腎炎模型組小鼠腎小球細胞外基質積聚明顯增加。⑶免疫熒光檢測顯示,在Control組小鼠腎組織中,periostin在腎小球細胞的細胞漿中微弱表達,而在LN組小鼠腎小球細胞的細胞漿中表達明顯增強;免疫組化顯示PCNA陽性信號在Control組和LN組小鼠腎小球細胞核均有表達,后者表達明顯強于前者。Fn在Control組小鼠腎小球中無明顯表達,在LN組腎小球、腎小管及間質中有明顯的陽性表達。TGF-β1在Control組小鼠腎小球中無明顯表達,而在LN組腎小球中有明顯的陽性表達。⑷Western blot結果表明,與Control組相比,LN組小鼠腎皮質periostin、PCNA、Fn、TGF-β1蛋白的相對表達量均顯著高于Control組。⑸ELISA結果顯示,與Control組相比,LN組血清PDGF-BB水平明顯增高。2 Periostin作為PDGF的下游因子上調體外培養(yǎng)小鼠系膜細胞的增殖水平和增加細胞外基質合成。⑴PDGF時間依賴性上調periostin蛋白表達。Western blot結果顯示,PDGF刺激組periostin蛋白表達顯著高于Control組。PDGF刺激2h后periostin水平開始升高,并于6h達到高峰,12h periostin水平明顯回落;細胞免疫熒光檢測結果顯示,在對照組,periostin在胞漿微弱表達,PDGF刺激組periostin在胞漿表達明顯增強。⑵PDGF上調小鼠系膜細胞增殖水平和細胞外基質表達。Western blot結果顯示,PDGF刺激組PCNA蛋白表達顯著高于Control組,PDGF刺激2h后小鼠系膜細胞PCNA水平開始升高,并于6h達到高峰;12h明顯回落;PDGF刺激組小鼠系膜細胞Fn、TGF-β1蛋白表達明顯升高,PDGF刺激4h后Fn、TGF-β1蛋白表達明顯增加,6h仍明顯增高,12h明顯回落。⑶periostin表達質粒使系膜細胞periostin、PCNA表達明顯增強,Fn、TGF-β1蛋白表達明顯增加。Western blot與免疫細胞化學檢測結果顯示與未轉染細胞和轉染空質粒細胞相比,轉染periostin表達質粒的小鼠系膜細胞periostin蛋白表達明顯增高,同時PCNA的表達明顯增強,Fn、TGF-β1蛋白表達明顯增加。⑷periostin沉默質粒部分逆轉PDGF引起的系膜細胞增殖和細胞外基質表達。Western blot和細胞免疫熒光檢測結果顯示,與PDGF刺激的未轉染組和轉染空質粒組比較,轉染sh-periostin質粒使periostin的蛋白表達顯著下降,并使PCNA的蛋白表達明顯下降。Western blot結果顯示periostin沉默質粒下調PDGF引起的Fn、TGF-β1蛋白表達。3敲低periostin表達有效降低LN組小鼠腎小球細胞增殖和細胞外基質增生水平及尿蛋白水平。⑴sh-periostin質粒有效下調狼瘡模型小鼠腎皮質periostin蛋白表達。免疫熒光和Western blot檢測結果顯示,與LN組和LN+sh-NC組小鼠相比,sh-periostin組小鼠腎小球periostin蛋白的表達明顯降低。⑵敲低腎組織中periostin表達降低了狼瘡模型小鼠腎小球細胞增殖水平。肉眼觀察,MRL/faslpr各組小鼠腎臟體積、質量均無明顯變化。光鏡下觀察,與LN組和LN+sh NC組相比,sh-periostin組小鼠腎小球細胞數目有所減少,但仍高于Control組。免疫組化和Western blot檢測結果顯示,與LN組和LN+sh-NC組小鼠相比,sh-periostin組小鼠腎小球PCNA蛋白的表達明顯降低。⑶敲低腎組織中periostin表達能夠降低狼瘡模型小鼠腎小球細胞外基質增生水平。PAS染色結果顯示,與LN組和LN+sh-NC組小鼠相比,sh-periostin組小鼠腎小球系膜區(qū)細胞外基質積聚減少,但仍高于Control組。免疫組化和Western blot檢測結果顯示,與LN組和LN+sh-NC組小鼠相比,sh-periostin組小鼠腎小球Fn、TGF-β1蛋白表達明顯降低。⑷敲低腎組織中periostin表達能夠降低狼瘡性腎炎模型小鼠尿蛋白水平。生化檢測結果顯示,與LN組小鼠相比,sh-periostin組小鼠24h尿蛋白量明顯降低,血Scr、BUN水平無明顯變化。4 PDGF通過激活PI3K/Akt信號通路來誘導periostin的表達,從而進一步引起系膜細胞增殖和細胞外基質表達增加。⑴PDGF促進小鼠系膜細胞中PI3K/Akt信號通路的活化。Western blot結果顯示,PDGF刺激小鼠系膜細胞后30min p-Aktser473出現表達高峰,2h和4h時表達仍持續(xù)升高,6h開始明顯下降,仍高于對照組,至12h時,p-Aktser473表達水平回落至正常水平。⑶PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002能夠抑制PDGF誘導的p-Aktser473、periostin、PCNA、Fn、TGF-β1的表達。Western blot結果顯示,與PDGF刺激組相比,PDGF+LY294002組較PDGF+DMSO組p-Aktser473、periostin、PCNA、Fn、TGF-β1表達明顯降低。結論1狼瘡性腎炎模型小鼠腎組織中periostin,PCNA、Fn、TGF-β1的表達水平明顯升高,而采用電穿孔轉染技術沉默腎組織中periostin表達能夠降低腎小球細胞增殖水平,減少細胞外基質積聚,減輕蛋白尿,提示periostin可能通過上調系膜細胞增殖和細胞外基質增生水平參與狼瘡性腎炎的發(fā)病及病變過程。2 PDGF誘導periostin在體外培養(yǎng)的小鼠系膜細胞表達增加,并上調系膜細胞增殖水平和細胞外基質表達水平。periostin表達質粒促進體外培養(yǎng)的小鼠系膜細胞增殖,細胞外基質合成增加。periostin沉默質粒部分逆轉PDGF引起的系膜細胞增殖和系膜細胞Fn、TGF-β1蛋白表達。PDGF通過激活PI3K/Akt信號通路誘導periostin表達,細胞增殖和細胞外基質積聚。上述結果提示,PDGF—Akt—periostin通路參與調控狼瘡性腎炎的腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質增多。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R593.242

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本文編號：1725258